博来霉素多次染毒诱导C57BL/6J小鼠肺纤维化模型

利用C57BL/6J小鼠制备肺纤维化模型。

3.1实验动物
C57BL/6J小鼠45 只（SPF 级），体重20--22g，10-12周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司〔动物合格证：SCXK（京）2015-0035〕，饲养和实验在中国医学科学院医学实验动物研究所动物房屏障环境内进行，温度为20-26℃，相对湿度50%-60%。

3.2试剂 
博来霉素（BLM）：注射用盐酸博来霉素，日本化药株式会社；盐酸氯胺酮注射液：沈阳市兽药厂，兽药字（2011）060022668；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒：碧云天；核固红染色液（0.5%）：北京雷根生物技术有限公司。

3.3模型建立
14周龄的雄性小鼠按体重随机分为未处理组（n=5）和处理组（n=40），处理组气管滴注BLM溶液（0.4 mg/ ml，每只100ul），未处理组小鼠不经任何处理，处理组小鼠用注射用盐酸氯胺酮150mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露声门，用接套管的1ml注射器气道给药。两星期给药一次，给药8次，第一次给药为0周，在0.5个月、1个月、2个月、4个月时分别取肺组织，称重，取右肺中叶做冰冻切片，剩余肺组织10%中性甲醛中固定制备石蜡切片做HE染色、Masson染色。

3.4 HE染色
肺组织10%中性甲醛中固定24h，常规脱水、石蜡包埋后，切片5um，进行苏木素—伊红染色，普通光学显微镜（BX50，Olympus, Japan）下观察肺组织病理学改变，病理学镜检人员进行单盲评分。

3.5 Masson染色 
肺组织石蜡切片脱蜡，蒸馏水冲洗，Masson染色复合液染色5min，自来水冲洗，0.2%醋酸浸洗，自来水冲洗，1%磷钨酸，水洗后亮绿染色液染色15min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻，脱水、透明、固封。

3.6 肺系数
小鼠在BLM处理0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取肺组织，称重，计算肺系数。肺系数=肺组织重量（mg）/小鼠体重（g）。

3.7 冰冻切片 
小鼠在0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取右肺中叶，速冻后，将肺组织浸没在适量的包埋剂中，用冰冻组织切片机制作8um的切片。

3.8 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法 
肺组织冰冻切片按试剂盒说明操作。先用试剂盒中固定液固定15min，PBS洗3次，每次3min，配置染色液，滴加到冰冻切片上，37℃培养箱（无CO₂）过夜后，PBS洗一遍，核固红（0.5%）复染15min，使细胞核变为红色，便于区分细胞。

3.9 统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，结果以均数±标准差（±S）表示，多组间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。