还原性物质（四唑蓝显色试验）检测

还原性物质检测，特别是采用四唑蓝（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，常简称为TTC或TTZ）作为显色剂的试验方法，是一种广泛应用于生物学、医药学、食品科学及环境监测领域的重要分析技术。该检测的核心原理在于利用四唑蓝盐在还原性物质（如脱氢酶、活性细胞、某些抗氧化剂、糖类、醛类等）存在下，被还原生成不溶于水的红色甲臜（Formazan）化合物。甲臜的生成量与样品中还原性物质的含量成正比，通过比色法测定其吸光度，即可实现对还原性物质的定性或定量分析。此方法因其灵敏度高、操作相对简便且成本较低而备受青睐。

检测项目

本检测项目主要针对样品中具有还原能力的物质进行定性和定量分析。具体应用包括但不限于：

• 细胞活力/增殖检测： 评估药物、毒素或环境因素对细胞活性的影响（如MTT、XTT、MTS试验均基于此原理）。
• 酶活性测定： 特别是脱氢酶类（如乳酸脱氢酶LDH、琥珀酸脱氢酶SDH）活性的测定。
• 抗氧化能力评价： 检测食品、保健品或生物样本中的总抗氧化能力。
• 特定还原性物质的检测： 如某些糖类（还原糖）、醛类化合物。
• 微生物活性检测： 评估土壤、水体或特定环境中微生物的代谢活性。

检测仪器

进行四唑蓝显色试验主要需要以下仪器设备：

• 酶标仪（Microplate Reader）： 核心设备。用于读取显色反应后微孔板中溶液的吸光度（Absorbance），通常在490 nm至570 nm波长范围内进行测定（具体波长取决于生成的甲臜类型和显色剂配方，常用490 nm或540 nm）。应具备恒温孵育功能或需配合恒温设备使用。
• 恒温培养箱/水浴锅： 提供反应所需的恒定温度环境（通常为37°C）。
• 微量移液器（Pipettes）及配套吸头： 用于精确移取各种溶液。
• 涡旋混合器（Vortex Mixer）： 用于混匀反应液。
• 96孔或384孔微孔板（Microplate）： 反应容器。
• 离心机（Centrifuge）： （可选，用于某些样品的前处理或终止反应后沉淀不溶物）。
• 分光光度计（Spectrophotometer）与比色皿： 如果采用试管法而非微孔板法，则需要此设备。

检测方法

典型的四唑蓝显色试验（以细胞活力检测为例）步骤如下：

1. 样品制备： 根据检测目标（细胞悬液、组织匀浆、血清、食品提取液等）进行适当的前处理。
2. 加样与孵育：
   • 将处理好的样品加入微孔板孔中。
   • 加入预定浓度的四唑蓝盐溶液（如MTT溶液、TTC溶液）。
   • 将微孔板置于恒温培养箱（通常37°C）中避光孵育一定时间（时间依具体方法和样品类型而定，如细胞试验常为1-4小时）。在此过程中，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶等可将黄色的四唑蓝还原为紫色（或红色）的甲臜结晶。
3. 终止反应与溶解甲臜：
   • 孵育结束后，弃去或吸出孔内上清液（含未反应的试剂）。
   • 加入溶解剂（如二甲基亚砜DMSO、酸化异丙醇、SDS-盐酸溶液等），充分振荡或吹打，使细胞内或孔底形成的甲臜结晶完全溶解。
4. 吸光度测定： 将溶解好的溶液置于酶标仪中，在特定波长（如570 nm，参考波长630 nm或650 nm）下测定各孔的吸光度值（OD值）。
5. 数据分析：
   • 计算各样品孔的OD值（通常需减去空白对照孔的OD值）。
   • 如果进行定量分析，需制备标准曲线（使用已知浓度的还原性物质标准品）。
   • 根据样品OD值，计算相对细胞活力、酶活性单位或还原性物质的浓度。

关键点：

• 避光操作： 四唑蓝及甲臜对光敏感，孵育和溶解过程应避光。
• 严格控制反应条件： 温度、时间、pH值、试剂浓度等需严格按照选定方法执行。
• 设置对照： 必须设置空白对照（仅含培养基和试剂，无样品）、阴性/阳性对照（如死细胞/活细胞对照）以确保结果可靠性。

检测标准

四唑蓝显色试验的具体操作标准和参数会因应用领域、检测目标和所采用的具体四唑蓝衍生物（如MTT, XTT, MTS, WST等）而有所不同。常见的参考标准和规范来源包括：

• 国际/国家标准： ISO、ASTM、GB等标准体系中与特定检测目标相关的方法标准（如细胞毒性测试标准ISO 10993-5）。
• 药典： 如《中华人民共和国药典》（ChP）、《美国药典》（USP）、《欧洲药典》（EP）中关于药品生物活性（如细胞活力）、杂质或特定成分检测的相关方法。
• 行业指南与权威文献： 相关领域（如肿瘤研究、免疫学、微生物学、食品分析）的权威期刊发表的实验方法、专业机构（如FDA、EMA）发布的指南中推荐或描述的方法。
• 试剂盒说明书： 商业化的四唑蓝法检测试剂盒通常会提供详细、标准化的操作步骤、反应条件和计算方式。

通用要求：

• 方法验证： 需要验证方法的专属性、线性范围、精密度（重复性、中间精密度）、准确度（回收率）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。
• 质量控制： 每次试验应包含必要的质控样品（QC）和对照。
• 结果报告： 报告应清晰说明采用的检测方法（包括四唑蓝种类）、主要步骤、关键参数、仪器型号、计算结果（含单位）以及使用的标准或参考依据。

注意事项

• 甲臜产物（如MTT生成的Formazan）可能具有一定的毒性或致癌性，操作时需佩戴手套，废弃物应按规定处理。
• 某些样品（如含高浓度蛋白质、脂质或色素的样品）可能对检测产生干扰，需进行适当的前处理或设置对照排除干扰。
• 溶解剂（如DMSO）的使用需注意安全，避免接触皮肤和粘膜。

检测机构资质证书

CMA认证

检验检测机构资质认定证书

证书编号：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS认可

实验室认可证书

证书编号：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO认证

质量管理体系认证证书

证书编号：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

关于我们

部分仪器

合作客户