非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法检测
在药品、化妆品、食品及医疗器械等行业中，非无菌产品（即生产过程未达到完全无菌状态的产品）普遍存在。虽然这些产品不需要完全无菌，但其微生物污染水平必须严格控制在安全范围内，以确保产品在使用或服用时不会对消费者健康构成风险（如引起感染或变质）。微生物限度检查（Microbial Limit Tests, MLT）正是评估这类产品微生物安全性的核心手段，它包含两项重要内容：微生物计数法（定量测定产品中活的微生物总数）和控制菌检查法（定性或定量检测特定致病菌）。本文将重点阐述微生物计数法的目的、涉及的关键检测项目、必备的检测仪器、标准的检测方法以及遵循的法定标准。
关键检测项目
微生物计数法的核心目标是定量测定非无菌产品中存在的可繁殖的微生物数量。根据微生物类群的不同，主要分为两个项目：
1. 需氧菌总数计数 (Total Aerobic Microbial Count, TAMC): 检测并计数产品中所有能在有氧条件下生长的细菌和酵母菌的总活菌数。这是评估产品整体微生物污染水平的最基本、最重要的指标。
2. 霉菌和酵母菌总数计数 (Total Combined Yeasts and Moulds Count, TYMC): 专门检测并计数产品中霉菌和酵母菌的活菌数。霉菌和酵母菌在特定环境（如高糖、低pH）中可能生长旺盛，单独计数有助于评估特定风险。
这两个项目的结果共同构成了对产品微生物负荷的全面评估，为判断该批次产品是否符合预定质量标准提供关键数据。
核心检测仪器
为确保微生物计数结果的准确性和可靠性，并保障实验人员安全，需要一系列专业、洁净的仪器设备：
1. 无菌操作环境： 这是实验的基础前提。必须使用达到ISO 5级（Class 100）或更高洁净度的生物安全柜 (Biological Safety Cabinet, BSC) 或 洁净工作台，以提供单向流无菌空气，保护样品和操作人员。
2. 薄膜过滤装置： 这是微生物计数法尤其推荐且常用的核心设备。主要包括：
* 滤杯/过滤漏斗：用于盛放供试液和滤膜。
* 滤膜：孔径为0.45μm或0.22μm。液体样品通过过滤，微生物被截留在膜表面。
* 真空泵：提供负压，驱动供试液快速通过滤膜。
* 集液瓶和管道：收集滤液。
3. 培养设备：
* 恒温培养箱：用于细菌培养（通常30-35°C）和霉菌、酵母菌培养（通常20-25°C）。
* 可调温湿度培养箱：某些标准可能要求控制湿度以促进霉菌生长。
4. 灭菌设备：
* 高压蒸汽灭菌器 (Autoclave)：用于对所有培养基、稀释剂、实验器具（如吸管、培养皿、镊子）、工作服等进行灭菌处理。
* 干热灭菌器：用于对玻璃器皿、金属器具等进行灭菌或除热原。
5. 其他辅助设备：
* 均质器/漩涡混合器：用于固体或半固体样品的均匀分散。
* 精密电子天平：用于精确称量样品和培养基。
* pH计：用于调节培养基和稀释液的pH值。
* 菌落计数器：用于准确计数平板上的菌落数。
* 显微镜：用于辅助观察和鉴定菌落形态。
标准检测方法
非无菌产品微生物计数法主要采用以下两种方法，其中薄膜过滤法是国际和国内药典的首选方法：
1. 薄膜过滤法 (Membrane Filtration Method):
* 原理： 取规定量的供试液（样品溶液或稀释液），通过孔径不大于0.45μm的微孔滤膜过滤。样品中可能存在的微生物被截留在滤膜表面。
* 操作： 将滤膜无菌转移至适宜的琼脂培养基平板上（需氧菌总数用大豆酪蛋白消化物琼脂培养基（Soybean-Casein Digest Agar, SCDA），霉菌和酵母菌总数用沙氏葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud Dextrose Agar, SDA））。滤膜应紧贴培养基表面，避免气泡。
* 培养： 需氧菌总数培养3-5天（30-35°C），霉菌和酵母菌总数培养5-7天（20-25°C）。
* 计数： 培养结束后，计算滤膜上生长的菌落数。
* 优点： 可处理较大体积样品，提高灵敏度；可去除样品中的抑菌成分（通过冲洗滤膜）；结果直观（菌落在滤膜上生长）。
* 适用性： 特别适用于水溶性供试液、抗生素等具有抑菌性的产品。
2. 平皿法 (Pour Plate Method / Spread Plate Method):
* 原理： 取规定量的供试液（通常1ml或0.1ml），注入无菌平皿中（倾注法），或滴加在已凝固的琼脂培养基表面并涂布均匀（涂布法），然后倾注或覆盖琼脂培养基。
* 培养与计数： 同薄膜过滤法。
* 适用性： 适用于无抑菌性或抑菌性很弱的固体制剂、乳膏等。操作相对简单，但灵敏度较低（可检测体积小），且抑菌成分可能影响结果。
方法选择： 应优先选择薄膜过滤法。当供试品具有抑菌性时，必须采用薄膜过滤法，并需进行方法学验证（特别是验证冲洗量是否足以去除抑菌性）。只有当供试品无抑菌性且仅采用平皿法即可达到检测目的，并经验证后，方可使用平皿法。
检测标准依据
全球范围内，非无菌产品的微生物限度检查（包括微生物计数法）主要遵循各国药典的规定。在中国，强制性的法定标准是：
《中华人民共和国药典》（Chinese Pharmacopoeia, ChP）:
* 通则 1105： “非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”。此通则详细规定了检查的环境要求、培养基、供试液的制备方法、计数方法（薄膜过滤法、平皿法）、结果报告规则、方法适用性试验（验证）的要求和操作步骤等。
* 通则 1106： “非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”（虽然本文重点在计数法，但完整限度检查需包含此部分）。
* 通则 1107： “非无菌药品微生物限度标准”。该标准根据不同药品的给药途径（如口服、局部给药、直肠、耳、鼻、吸入、阴道、口腔黏膜等）和剂型（如中药制剂、化学药品制剂、药用原料及辅料）规定了TAMC和TYMC的可接受限度（通常以 CFU/g, CFU/ml, 或 CFU/unit 表示）。例如，口服固体制剂的TAMC通常要求 ≤ 1000 CFU/g， TYMC ≤ 100 CFU/g。
* 通则 9201： “药品微生物检验替代方法验证指导原则” - 为采用药典方法以外的替代方法提供验证指南。
* 通则 9203： “药品微生物实验室质量管理指导原则” - 规范微生物实验室的管理和运行。
其他重要国际/区域标准：
* 《美国药典》(USP) <61> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests
* 《欧洲药典》(Ph. Eur.) 2
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