产志贺毒素大肠杆菌检测
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发布时间:2025-07-19 12:01:18 更新时间:2025-07-18 12:01:18
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作者:中科光析科学技术研究所检测中心
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产志贺毒素大肠杆菌是一类能够产生强效细胞毒素——志贺毒素的大肠杆菌,主要包括大肠杆菌O157:H7和其他非O157血清型(如O26、O45、O103、O111、O121、O145等)。它们是人类食源性疾病的重要病原体,常通过受污染的食品(如未煮熟的碎牛肉、生鲜牛奶、被污染的蔬菜水果、水源)传播,可引起从轻微腹泻到严重的溶血性尿毒综合征等严重后果。因此,建立快速、准确、可靠的产志贺毒素大肠杆菌检测体系,在食品安全监测、疫情溯源、临床诊断和公共卫生应急响应中至关重要。
产志贺毒素大肠杆菌的检测核心在于确认目标菌株及其毒力特性:
1. 目标病原体筛查与分离: 首要目标是从待检样本(食品、环境样本、粪便等)中分离出疑似大肠杆菌菌落。
2. 志贺毒素基因检测: 这是确认产毒能力的金标准。主要检测编码志贺毒素Stx1和Stx2的特异性基因片段(stx1和stx2)。这是判断是否为STEC的核心依据。
3. 重要毒力因子检测: 检测与严重疾病相关的毒力因子,如紧密粘附素基因(eae,与附着抹平病变相关),溶血素基因(hlyA),以及质粒编码的毒力因子(如ehxA)。
4. O抗原血清群分型: 利用特异性抗血清或分子方法对分离株进行O抗原分型(如O157、O26、O103、O111、O121、O145等),以确定其是否属于重点关注的高致病性血清群。
5. H抗原血清分型: 如O157:H7中的H7,提供更精细的分型信息,有助于溯源。
完成上述检测项目需要一系列专业仪器设备:
1. 微生物培养设备: 恒温培养箱、生物安全柜(用于无菌操作)、均质器(处理食品样本)、厌氧培养系统(部分选择性培养需要)。
2. 分子生物学检测平台: * 聚合酶链式反应仪: 用于扩增stx1, stx2, eae等特异性基因片段。是基因检测的核心设备。 * 实时荧光定量PCR仪: 在PCR扩增过程中实时监测荧光信号,实现快速、高灵敏度、高特异性的基因检测和定量(若需要),是目前主流的快速检测方法。 * 核酸提取仪: 自动化提取样本中的DNA/RNA,提高效率和一致性。 * 电泳系统: (传统PCR后)用于分离和观察扩增产物,包括凝胶成像系统。 * 微阵列或测序平台: 用于更全面的毒力基因谱分析或菌株溯源(如全基因组测序WGS)。
3. 免疫学检测设备: * 酶标仪: 用于读取酶联免疫吸附试验的结果,检测志贺毒素蛋白或特定血清型抗原。 * 免疫磁珠分离系统: 利用包被特异性抗体(如抗O157)的磁珠从复杂样本中富集目标菌,提高分离效率(常用于O157:H7)。
4. 生化鉴定系统: 自动化或半自动化微生物鉴定仪(如VITEK, API 20E),辅助鉴定大肠杆菌并进行初步生化分型。
5. 血清学分型设备: 玻片、试管、离心机等,用于传统的凝集试验。
6. 细胞培养设备(选择性): 用于Vero细胞毒性试验(检测志贺毒素生物活性),需要CO2培养箱、倒置显微镜等,通常在专业实验室进行。
检测方法通常遵循“初筛-确证-分型”或“培养-非培养”相结合的策略:
1. 培养分离法(金标准): * 富集培养: 样本在选择性增菌肉汤(如改良EC肉汤加新生霉素,mEC+n)中孵育,促进目标菌生长。 * 分离培养: 将富集液接种到选择性/鉴别性平板(如O157专有的山梨醇麦康凯琼脂SMAC、CHROMagar™ STEC显色培养基;非O157常用彩虹®O157 H7平板或含特定抗生素的培养基)。挑取可疑菌落(如O157在SMAC上呈不发酵山梨醇的灰白色菌落)。 * 生化和血清学鉴定: 对可疑菌落进行生化试验(吲哚、MR-VP等)确认大肠杆菌,再用特异性抗血清进行O和H抗原凝集试验鉴定血清型。
2. 免疫学方法: * 酶联免疫吸附试验: 直接检测样本(富集后)或分离株中的志贺毒素(Stx)或特定O抗原(如O157抗原)。有商品化试剂盒。 * 免疫层析试纸条: 快速检测Stx或特定血清型抗原,操作简便,适合现场或初筛。 * 免疫磁珠分离: 通常作为富集和分离特定血清型(尤其是O157:H7)的前处理步骤,与后续培养或检测联用。
3. 分子生物学方法(核心快速确证方法): * 聚合酶链式反应: 针对stx1, stx2, eae等特异性基因设计引物,对增菌液或分离株进行DNA扩增,通过凝胶电泳或实时荧光(更快速、避免污染)判断结果。可直接在增菌液中进行,大大缩短检测周期。 * 多重PCR: 在同一反应中同时扩增多个靶基因(如stx1, stx2, eae, O-群特异性基因),提高效率。 * 实时荧光定量PCR: 目前最主流的快速检测方法,灵敏度高、特异性强、速度快,可定量(可选),并实现闭管检测减少污染风险。 * 基因芯片/微阵列: 可一次性检测大量毒力基因和血清型标记,信息量大,但成本较高。
4. 细胞毒性试验(确证毒素活性): 将样本滤液或培养上清液加入Vero或Hela细胞,观察细胞病变效应来确认志贺毒素的生物活性,是毒素检测的“黄金标准”,但操作繁琐耗时,通常用于研究或疑难样本的确证。
为确保检测结果的准确性、可靠性和可比性,必须遵循国际和国内公认的标准方法:
1. 国际标准: * ISO/TS 13136:2012《食物链微生物学-实时荧光PCR检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)和O157、O111、O26、O103及O145血清群测定指南》: 这是国际公认的核心标准,详细规定了使用实时荧光PCR检测食品中STEC特异性基因(stx和eae)以及重点血清型的方法。 * ISO 16654:2001《食品和动物饲料的微生物学-大肠杆菌O157的水平检测方法》: 专门针对O157:H7的检测方法(培养法为基础)。
2. 国际组织指南: * 国际食品法典委员会: 发布的指南文件对STEC的风险管理和控制具有重要参考价值。
3. 国家标准(示例,需依据具体国家): * 中国: GB 4789.36-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》(主要针对O157); GB 4789.6-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》(包含部分STEC的检测,侧重临床腹泻样本); SN/T 0973-2013《进出口肉及肉制品检验规程》(包含STEC相关要求)。针对非O157 STEC的国家标准正在发展和完善中。 * 美国: FDA《细菌学分析手册》中包含STEC检测章节;
证书编号:241520345370
证书编号:CNAS L22006
证书编号:ISO9001-2024001
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