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水稻内标基因PEPC检测

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发布时间：2025-07-20 02:14:00 更新时间：2025-07-19 02:14:00

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

水稻内标基因PEPC检测技术详解

水稻是重要的粮食作物，其品质与安全检测至关重要。在转基因水稻检测、品系鉴定或病原体检测等分子生物学分析中，为确保结果的准确性和可靠性，必须引入内标基因（Internal Control Gene, ICG）。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（Phosphoenolpyruvate Carboxylase, PEPC）是水稻基因组中一个高度保守的单拷贝基因，因其表达稳定、拷贝数恒定、在水稻所有组织器官中均存在且不受处理影响，被广泛认可为水稻分子检测的理想内标基因。PEPC内标基因的检测主要用于监控DNA/RNA提取质量、PCR扩增效率以及反应体系中是否存在抑制物，是判断整个检测过程是否有效、结果是否可信的关键质控环节。

检测项目

水稻PEPC内标基因检测的核心项目包括：

1. DNA提取质量监控： 通过检测PEPC基因，确认从水稻组织样本中成功提取到足量且质量合格的基因组DNA，排除提取失败或DNA降解的情况。这是进行后续任何基于DNA的检测（如转基因事件筛查、品种鉴定）的前提。
2. PCR / qPCR 反应有效性监控： 在实时荧光定量PCR（qPCR）或常规PCR反应体系中，同时扩增PEPC基因。其成功扩增（出现预期的特异性条带或达到设定的Ct值）表明反应体系本身（包括试剂、仪器、程序）工作正常，无抑制物干扰，确保针对目标基因或外源基因的检测结果是可靠的。若PEPC未检出，则整个检测结果无效，需排查原因（如DNA质量差、反应体系被抑制等）。
3. 定量分析的参照： 在绝对定量（如确定转基因成分拷贝数）或相对定量（如基因表达量差异分析）中，PEPC常作为内参基因用于校正样品间的差异（如DNA模板量、扩增效率差异），使目标基因的定量结果更准确、可比。

检测仪器

进行水稻PEPC内标基因检测主要依赖以下核心仪器设备：

1. 核酸提取设备： 组织研磨仪/匀浆仪、离心机（用于组织破碎和核酸分离）、核酸提取仪（可自动化完成提取过程）或磁力架（配合磁珠法提取试剂盒）。
2. 光谱光度计/荧光计： 用于测定提取的DNA/RNA浓度和纯度（如A260/A280, A260/A230比值）。
3. PCR仪： 用于常规PCR扩增。
4. 实时荧光定量PCR仪： 用于进行实时荧光定量PCR检测，这是目前检测PEPC内标基因（尤其在监控qPCR反应有效性方面）最常用、最灵敏、最定量化的手段。仪器需配备适用于常用荧光染料（如FAM, SYBR Green I, VIC等）的光学模块。
5. 电泳系统： 用于常规PCR产物的分离和可视化（琼脂糖凝胶电泳）或毛细管电泳（用于高分辨率分析如片段分析）。包括电泳槽、电源、凝胶成像系统或毛细管电泳仪。
6. 数据分析软件： 与实时荧光定量PCR仪配套的软件，用于设定程序、采集荧光信号、计算Ct值、分析熔解曲线、进行定量计算等。

检测方法

水稻PEPC内标基因检测的标准流程通常包括以下步骤，核心方法是PCR或qPCR：

1. 样品制备： 采集代表性水稻样品（种子、叶片、稻谷等），按照标准操作程序（SOP）进行研磨粉碎。
2. 核酸提取： 使用经过验证的DNA提取试剂盒（如CTAB法、SDS法、商业化柱提法或磁珠法）提取水稻基因组DNA。提取过程中需设置阴性对照（如不含样品的提取液）以监控污染。提取后测定DNA浓度和纯度。
3. 引物/探针设计： 针对水稻PEPC基因的特异性保守区域设计引物。对于qPCR，通常设计特异性探针（如TaqMan探针）或使用高特异性的SYBR Green I染料法。引物和探针序列需经过特异性验证（BLAST比对）和效率验证（标准曲线）。常用引物序列示例（供参考，实际需验证）：
- 正向引物（Forward Primer）: 5'-TCCACCTTCTTCTCCGCCAT-3'
- 反向引物（Reverse Primer）: 5'-CCTTGGTCAAGAACGTCGTG-3' (预期产物长度约100-150 bp)。
4. PCR / qPCR 反应设置：
- 常规PCR: 在PCR反应管/板中加入DNA模板、特异性引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、反应缓冲液、Mg2+等。设置合适的循环参数（变性-退火-延伸温度和时间及循环数）。需设置阴性对照（NTC, 无模板）和阳性对照（已知含有PEPC的水稻DNA）。
- 实时荧光定量PCR (qPCR): 在反应管/板中加入DNA模板、引物、探针（若用）或SYBR Green Master Mix、ROX参比染料（用于校正孔间误差）等。反应体系与程序需优化。除NTC和阳性对照外，建议设置内标阳性对照（IPC，即人为添加已知浓度的PEPC质粒或合成片段，监控整个qPCR过程）。
5. 扩增与分析：
- 常规PCR: 反应结束后，取产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统观察。预期大小位置出现单一、明亮的条带表明PEPC扩增成功。
- qPCR: 仪器实时监测荧光信号并绘制扩增曲线。软件自动计算Ct值（达到设定荧光阈值所需的循环数）。成功扩增表现为：阳性对照和样品在预期Ct值范围内（通常在15-35之间，具体取决于初始DNA量和反应效率）出现典型的S型扩增曲线；阴性对照无扩增或Ct值极大（如>40或Undetermined）。使用染料法时，必须进行熔解曲线分析（Dissociation Curve Analysis）以确认扩增产物的特异性（单一尖锐峰）。
6. 结果判读：

阳性： 样品出现预期的特异性扩增（凝胶上清晰条带或qPCR中Ct值在有效范围内且熔解曲线单一峰），表明DNA提取合格且PCR/qPCR反应有效。
阴性： 样品无扩增（凝胶上无条带或qPCR中无Ct值/Ct值极大），同时阳性对照扩增良好，则强烈提示该样品的DNA提取失败（无DNA/严重降解）或存在强效PCR抑制物，整个检测结果无效。
可疑/无效： 阳性对照未扩增，则整个批次实验无效，需排查试剂、仪器或程序问题。NTC出现扩增表明存在污染。

检测标准

水稻PEPC内标基因的检测应遵循相关的国家标准、行业标准或国际指南，以确保方法的规范性、准确性和可比性：

1. GB/T 19495.4-2018 《转基因产品检测实验室技术要求》： 该标准规定了转基因产品检测实验室的通用要求，包括环境、设备、人员、样品管理、方法验证、质量控制等，适用于包含PEPC检测在内的任何分子检测实验室。
2. GB/T 19495.5-2018 《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》： 这是中国进行转基因成分定量检测的核心标准。虽然其重点在外源基因定量，但明确规定了内标基因（如PEPC）的检测要求：包括内标基因的选择原则（物种特异性、单拷贝、稳定）、引物探针设计验证、方法特异性/灵敏度/效率/线性范围验证、实验内/间重复性要求、在反应体系中的使用方式（通常与外源基因/内源基因多重检测或单独检测）、结果有效性判读标准（如PEPC Ct值必须在规定范围内，否则样品结果无效）。该标准是进行水稻PEPC qPCR检测必须遵循的基准。