水稻内标基因SPS检测

水稻作为全球最重要的粮食作物之一，其遗传改良和品质鉴定备受关注。在分子生物学检测领域，尤其是转基因成分鉴定、品种真实性鉴定、纯度检测及基因表达分析等应用中，需要使用可靠的内标基因（Internal Positive Control, IPC）以确保实验结果的准确性和可靠性。蔗糖磷酸合成酶基因（Sucrose Phosphate Synthase Gene, SPS）因其在水稻基因组中具有拷贝数恒定、序列高度保守、表达稳定且不易受环境影响等优点，被广泛认可为水稻分子检测中理想的内标基因之一。SPS基因的检测作为实验体系的阳性对照，其核心作用在于确认核酸提取成功、PCR反应体系有效且未受到抑制，为后续目标基因（如外源转基因片段或特定品种特征基因）的准确检测提供必要的前提保障。

检测项目

水稻内标基因SPS检测的核心项目是验证样品中水稻基因组特异性DNA的存在与否及完整性。其主要目的包括：

• 核酸提取质量验证： 确认从水稻样品（种子、叶片、米粉等）中成功提取到足量且未降解的基因组DNA。
• PCR反应体系有效性监控： 作为PCR扩增反应的阳性对照，证明反应体系（如Taq酶活性、引物设计、缓冲液、热循环条件等）工作正常，不存在抑制因子。
• 样品真实性确认： 在转基因检测或品种鉴定时，确认待测样品确实来源于水稻，排除非水稻物质干扰。
• 定量分析的参照基准： 在实时荧光定量PCR（qPCR）中，SPS基因常作为内参基因，用于对目标基因的定量结果进行标准化校正（如使用ΔΔCt法），消除样品间加样量、核酸浓度及扩增效率的差异。

检测仪器

进行水稻SPS基因检测通常需要以下核心仪器设备：

• 核酸提取设备： 组织研磨仪/匀浆仪、离心机（高速和微量）、恒温水浴锅/金属浴、微量移液器。
• PCR扩增设备：
  • 普通PCR仪： 用于终点法PCR扩增SPS基因片段。
  • 实时荧光定量PCR仪： 用于定量检测SPS基因，提供高灵敏度和准确性，并能实时监测扩增过程。这是目前最常用和推荐的方法。
• 电泳及成像系统（用于终点法PCR）： 水平电泳槽、电源、凝胶成像系统（或紫外透射仪）用于观察扩增产物条带。
• 辅助设备： 超净工作台/生物安全柜（用于无菌操作）、超微量分光光度计/Nanodrop（用于核酸浓度和纯度检测）、冰箱（-20℃, -80℃）和冰盒（用于试剂和样品保存）。

检测方法

水稻SPS基因检测主要采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术，具体方法包括：

1. 核酸提取： 采用标准的植物基因组DNA提取方法（如CTAB法或商品化试剂盒）从水稻样品中提取总DNA。提取的DNA需进行浓度和纯度（A260/A280, A260/A230）检测。
2. 引物设计与合成： 根据已公开的水稻SPS基因保守序列（如GenBank登录号中的序列），设计特异性引物。常用的SPS引物序列示例如下（具体序列需根据目标区域和检测需求优化）：

   SPS Forward (F): 5'-GTG GAG AAG ATC CGC ATG AA-3'

   SPS Reverse (R): 5'-GCA TCT CTT GGA GCA AGC TC-3'

   预期扩增片段长度通常在100-200 bp左右（适合qPCR）或更长（适合普通PCR电泳）。引物需确保特异性，避免与其他作物或水稻其他基因非特异性结合。

3. PCR扩增：
   • 普通PCR（终点法）： 在PCR反应管中加入模板DNA、特异性引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液（含MgCl2）和适量水。设置优化的热循环程序（通常包括：预变性95℃ 3-5min；变性95℃ 30s, 退火55-62℃ 30s, 延伸72℃ 30-60s，循环30-40次；终延伸72℃ 5-10min）。
   • 实时荧光定量PCR（qPCR）： 在qPCR反应板/管中加入模板DNA、特异性引物、荧光染料（如SYBR Green I）或探针（如TaqMan探针）、dNTPs、热启动Taq DNA聚合酶、qPCR缓冲液和适量水。在实时荧光定量PCR仪上运行程序（通常包括：预变性/激活95℃ 30s-10min；两步法循环：变性95℃ 5-15s, 退火/延伸 & 荧光采集60℃ 30-60s，循环40次；或三步法循环）。仪器实时监测荧光信号变化，生成扩增曲线。
4. 结果分析：
   • 普通PCR： 取PCR产物进行琼脂糖凝胶（通常1.5-2%）电泳，在凝胶成像系统中观察，阳性样品应在预期大小处出现清晰明亮的特异性条带，阴性对照（无模板对照，NTC）应无条带。
   • qPCR： 分析软件根据扩增曲线自动或手动设定阈值（Threshold），计算Ct值（荧光信号达到阈值所需的循环数）。阳性样品应出现典型的S形扩增曲线，且Ct值在设定的合理范围内（通常在20-35个循环以内，具体取决于模板浓度和反应效率）。阴性对照应无扩增曲线或Ct值>40（或未检出）。熔解曲线分析（针对SYBR Green法）应呈现单一特异峰，确认无非特异性扩增或引物二聚体。

检测标准

水稻内标基因SPS检测是遵循一系列国际、国家或行业标准的分子检测步骤中的关键组成部分。相关的标准主要包括：

• ISO 21571:2005/Amd 1:2013 - 食物链微生物学 - 转基因生物和衍生产品检测的分析方法 - 核酸提取： 提供核酸提取的通用原则和验证要求。
• ISO 21569:2005/Amd 1:2013 - 食物链微生物学 - 转基因生物和衍生产品检测的分析方法 - 基于核酸的定性方法： 规定了定性PCR检测（包括内标基因检测）的方法学要求和性能标准（如特异性、灵敏度、稳健性）。内标基因（如SPS）的扩增是证明方法有效性的必要阳性对照。
• ISO 21570:2005/Amd 1:2013 - 食物链微生物学 - 转基因生物和衍生产品检测的分析方法 - 基于核酸的定量方法： 详细规定了qPCR定量检测（包括使用内参基因如SPS进行相对定量）的严格技术要求，涵盖方法验证、质控措施、数据分析和结果报告等。
• GB/T 19495 系列标准（转基因产品检测）： 中国国家标准，其中多个部分（如GB/T 19495.3-2004 核酸提取纯化方法， GB/T 19495.4-2004 核酸定性PCR检测方法， GB/T 19495.5-2004 核酸定量PCR检测方法）都明确要求在转基因水稻成分检测中必须包含水稻特异性内标基因（如SPS基因或PLD基因）作为阳性对照或内参，并对引物设计、反应体系、质控点、结果判读等做出规定。
• 行业指南/实验室自建方法： 许多权威检测机构和实验室会制定更具体的SOP（标准操作程序），明确SPS基因检测所用引物序列、反应条件、质控标准（如Ct值范围、阴性/阳性对照要求、扩增效率等）。

综上所述，水稻内标基因SPS检测是一项标准化

检测机构资质证书

CMA认证

检验检测机构资质认定证书

证书编号：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS认可

实验室认可证书

证书编号：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO认证

质量管理体系认证证书

证书编号：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

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