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哺乳动物培养细胞染色体畸变试验（致突变实验）检测

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发布时间：2025-07-21 20:52:58 更新时间：2025-07-20 20:52:58

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

哺乳动物培养细胞染色体畸变试验（致突变实验）检测

哺乳动物培养细胞染色体畸变试验是遗传毒理学研究中一项至关重要的体外致突变性检测方法。该试验的核心目的是评估受试化学物或物理因素（如辐射）诱导哺乳动物细胞染色体结构畸变的能力。染色体畸变（如断裂、缺失、易位、环状染色体等）是DNA严重损伤的直观表现，也是潜在致癌物和遗传毒性物质的早期预警信号。因其具有敏感性高、周期相对较短、条件可控等优势，该试验被广泛应用于新药研发、食品安全评估、环境污染物筛查、工业化学品注册（如REACH法规）及辐射生物学研究等领域，是国际公认的标准遗传毒性检测组合（如ICH S2(R1)、OECD指南）中的关键组成部分，为预测受试物潜在的遗传危害和致癌风险提供重要科学依据。

检测项目

本试验直接观察和定量分析的主要检测项目包括：

染色体结构畸变：
- 染色体型畸变：包括染色体断裂、断片、双着丝粒体、环状染色体、微小体、易位（需显带技术确认）等。
- 染色单体型畸变：包括染色单体断裂、染色单体交换（裂隙通常不计入畸变，除非明确为断裂）。
畸变细胞率：发生至少一种染色体结构畸变的细胞占分析细胞总数的百分比。
畸变总数/细胞或特定类型畸变频率（如双着丝粒体/细胞）。

观察通常在细胞分裂中期相进行，此时染色体形态最清晰。

检测仪器

完成该试验需要一系列精密的实验室仪器和设备：

细胞培养系统：CO₂培养箱、生物安全柜/超净工作台、倒置相差显微镜（用于日常观察细胞状态）、离心机（用于细胞收获和洗涤）。
样品制备：恒温水浴锅（用于低渗处理）、真空泵（用于细胞固定时抽吸上清）、移液器及耗材。
染色体标本制备：离心机（配备甩片头的为佳）、冰箱（储存固定液、染液）、载玻片及盖玻片。
染色体观察与分析：
- 光学显微镜：配备高倍物镜（100倍油镜）的优质正置或倒置显微镜是核心设备。
- 显微成像系统：高分辨率CCD相机及配套图像采集与分析软件，用于拍摄、储存和测量染色体图像。
- 染色体核型分析系统（可选，用于复杂畸变如易位的确认）。
其他辅助设备：pH计、天平、计时器等。

检测方法

试验遵循标准化的流程，主要步骤包括：

细胞系选择与培养：常用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、中国仓鼠肺细胞（CHL或V79）或人外周血淋巴细胞（需刺激分裂）。细胞在适宜培养基中培养至对数生长期。
受试物处理：
- 设多个剂量组（包括最高浓度受溶解度或细胞毒性限制）、溶剂/阴性对照组、阳性对照组（如丝裂霉素C、环磷酰胺等）。
- 处理时间通常包括短期处理（3-6小时加或不加S9代谢活化系统）和长期处理（持续处理1.5个正常细胞周期，约18-24小时，通常不加S9）两种方案，以检测不同作用机制的诱变剂。
- S9混合物（哺乳动物肝脏微粒体酶系）用于模拟体内代谢活化过程。
细胞收获与染色体标本制备：
- 加入秋水仙胺或秋水仙素，阻断纺锤体形成，使细胞停滞于分裂中期。
- 低渗处理（常用0.075M KCl溶液）：使细胞膨胀，染色体分散。
- 固定：多次使用冰醋酸:甲醇（1:3）固定液固定细胞，去除蛋白质和细胞质。
- 滴片：将细胞悬液滴在洁净预冷的载玻片上，空气干燥。
- 染色：常用Giemsa染色，使染色体清晰显色。
染色体畸变观察与分析：
- 在显微镜下油镜下系统扫描玻片。
- 每个剂量组和对照组通常要求分析100-200个（或更多）结构良好的中期分裂相（OECD 473推荐每个培养物至少200个中期相，分给两位阅片者）。
- 由经过培训的阅片员采用盲法记录每个中期相的畸变类型和数量。
- 计算畸变细胞率和各类畸变频率。
数据处理与结果判断：
- 采用适当的统计学方法（如卡方检验、Fisher精确检验）比较各处理组与阴性对照组的畸变率差异。
- 结合剂量-反应关系、重现性、阳性对照结果以及细胞毒性水平（如相对细胞生长抑制率、有丝分裂指数）综合判断受试物是否具有诱导染色体畸变的潜力。

检测标准

该试验的实施、结果解释与报告必须严格遵循国际和国内权威机构制定的标准化指南，确保数据的科学性、可靠性和可比性。主要标准包括：

国际标准：
- OECD Test Guideline No. 473: In Vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test：经济合作与发展组织的核心标准，被全球广泛采纳。
- ICH Harmonised Guideline S2(R1): Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use：国际人用药品注册技术协调会标准，为药物遗传毒性测试提供指导。
中国国家标准：
- GBZ/T 240.8-2011 化学品毒理学评价程序和试验方法第8部分：哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验（注：虽然主要针对骨髓，但细胞培养部分原理和评价要求高度相通，实践中培养细胞试验也广泛参考）。针对体外培养细胞的专门标准可能会引用或等效采用OECD 473。
- 药品、化妆品、农药等相关行业的注册技术指导原则中通常明确要求或推荐参照OECD 473或ICH S2(R1)进行该试验。

这些标准对试验的关键要素，如细胞系选择、浓度设置（包括最高浓度确定原则）、对照组设置、处理方案（短时/持续）、S9使用、阅片要求（中期相质量、阅片数量、阅片者间一致性）、数据处理统计方法以及结果判定的标准（如阳性反应的统计学显著性和剂量依赖性）等，都做出了详细的规定。合规性是试验有效性和数据被管理机构接受的前提。