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国境口岸蚊类携带基孔肯雅病毒检测

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发布时间：2025-07-21 15:29:35 更新时间：2025-07-20 15:29:53

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

一、引言

基孔肯雅热（Chikungunya fever）是由基孔肯雅病毒（CHIKV）引起、经伊蚊（主要是埃及伊蚊和白纹伊蚊）传播的急性传染病。临床特征为突发高热、剧烈关节疼痛和皮疹，部分患者可遗留持续性关节疼痛。CHIKV在全球热带和亚热带地区广泛流行，对公共卫生构成严重威胁。

国境口岸作为人员、货物和国际交通工具往来的枢纽，是防止传染病跨境传播的第一道防线。开展口岸蚊类携带CHIKV的监测与检测，对于早期预警、风险评估、精准防控输入性疫情至关重要。本指南旨在系统介绍国境口岸蚊类CHIKV检测的标准、方法、仪器及流程。

二、检测的重要性与目标

重要性：
- 监测病毒输入风险： 及时发现随入境交通工具或货物携带的蚊虫是否感染CHIKV。
- 评估本地传播潜力： 掌握口岸及周边地区媒介蚊虫的感染状况，评估本地传播风险。
- 指导防控措施： 为采取针对性灭蚊、疫情预警、旅行健康建议等提供科学依据。
- 履行国际卫生条例义务： 加强口岸核心能力建设，防止疾病国际传播。
目标：
- 快速、准确、灵敏地检测蚊虫样本中是否存在CHIKV核酸或病毒粒子。
- 对阳性结果进行确认和分析。
- 为风险评估和决策提供及时可靠的实验室数据。

三、检测相关标准与规范

国境口岸蚊类CHIKV检测需严格遵循国内外相关标准和规范，确保检测结果的可靠性、可比性和法律效力：

国内标准：
- 《国境口岸病媒生物监测规程》系列标准： 规定了口岸蚊类监测的总体要求、方法（包括采样点设置、采样方法、样本处理等）。
- SN/T 2770-2011 《国境口岸基孔肯雅病毒检测方法》： 现行有效的专门针对国境口岸CHIKV检测的行业标准，详细规定了分子生物学检测（RT-PCR）和病毒分离的操作步骤、试剂、仪器和质量控制要求。
- GB 19489 《实验室生物安全通用要求》： 规定实验室生物安全分级（如BSL-2）及防护要求，所有涉及活病毒的操作必须在此标准框架下进行。
- 《病原微生物实验室生物安全管理条例》： 对高致病性病原微生物（CHIKV属于第三类）的运输、保存、实验活动等有明确规定。
国际参考：
- 世界卫生组织（WHO）指南： 如《基孔肯雅病毒实验室诊断指南》等，提供最新的诊断策略、方法学建议和质量保证框架。
- 世界动物卫生组织（WOAH，原OIE）手册： 对虫媒病毒检测也有相关参考。
- 国际标准化组织（ISO）相关标准： 如ISO/IEC 17025 《检测和校准实验室能力的通用要求》，是实验室质量管理体系的重要依据。

四、主要检测方法

分子生物学检测（核心方法）：
- 原理： 检测病毒特异性核酸（RNA）。
- 方法：
  - 逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）： 经典方法。提取蚊虫样本总RNA，通过逆转录酶合成cDNA，再通过PCR扩增病毒特异性片段（如E1、nsP1等基因片段），通过凝胶电泳观察扩增条带判断结果。优点： 相对简单、成本较低。缺点： 需开盖进行电泳，污染风险略高，灵敏度低于实时荧光法。
  - 实时荧光逆转录聚合酶链式反应（Real-time RT-PCR / qRT-PCR）： 目前最常用、推荐的首选方法。 在PCR反应体系中加入荧光标记探针（如TaqMan探针）或荧光染料（如SYBR Green），实时监测扩增过程中荧光信号的变化，实现核酸的定量或定性检测。优点： 闭管操作，污染风险低；灵敏度高、特异性强；可定量；速度快（通常2-4小时出结果）。
- 关键点：
  - 引物/探针设计： 针对CHIKV保守区域（如结构蛋白E1、E2或非结构蛋白nsP1、nsP4基因）设计特异性引物和探针。需定期验证其有效性。
  - 内参： 应设置内源性对照（如蚊虫管家基因Actin、RPS6等）以监测RNA提取质量和抑制物存在。
  - 灵敏度与特异性： 通常可检测到极低拷贝数的病毒RNA，并能有效区分CHIKV与其他黄病毒（如登革热病毒、寨卡病毒）。
病毒分离（金标准）：
- 原理： 利用活的敏感细胞系（如C6/36蚊细胞、Vero E6猴肾细胞）或乳鼠脑内接种，从样本中分离出活的CHIKV。
- 方法： 将蚊虫样本研磨悬液接种细胞，观察细胞病变效应（CPE），或接种乳鼠观察发病情况。分离到的病毒需通过免疫荧光（IFA）、RT-PCR或中和试验进行鉴定。
- 地位： 被认为是病毒检测的“金标准”，能获得活病毒用于分型、溯源、耐药性等深入研究。
- 局限性： 耗时长（通常需数天至数周）、成本高、操作复杂、生物安全要求极高（需在BSL-3实验室进行增殖后的操作），不适合作为口岸常规快速筛查的首选方法。主要用于阳性样本的确证、毒株特性研究或分子方法结果不明确时。
血清学检测（主要用于人或动物诊断，蚊类检测不常用）：
- 原理： 检测病毒特异性抗体（如IgM, IgG）。
- 方法： 酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光试验（IFA）、中和试验（PRNT）等。
- 在蚊类检测中的应用： 一般不适用于蚊虫样本的直接检测，因为蚊虫不产生针对病毒的抗体。主要用于监测人群或特定动物宿主的感染率，间接反映传播风险。

五、检测仪器与设备

开展口岸蚊类CHIKV检测需要配备以下核心仪器设备：

样本前处理与保存：
- 低温冰箱： -20°C（短期保存样本）、-70°C或液氮（长期保存样本/病毒株）。
- 生物安全柜（BSC）： II级A2或B2型（必备！）。所有可能产生气溶胶或涉及感染性材料的操作（如样本匀浆、核酸提取、加样、病毒分离）必须在BSC内进行。
- 高速离心机（带生物安全转头）： 用于样本、裂解液等的离心。
- 组织研磨器/匀浆器： 用于蚊虫样本的粉碎匀浆（需在BSC内使用）。
- 涡旋振荡器： 用于混匀样本和试剂。
分子生物学检测（RT-PCR / qRT-PCR）：
- 核酸提取仪及配套试剂盒： 自动化提取蚊虫样本总RNA（推荐使用柱式法或磁珠法）。常用品牌：QIAGEN, Thermo Fisher, Roche, Bioer等。
- PCR仪： 用于常规RT-PCR扩增。
- 实时荧光定量PCR仪（qPCR仪）： 进行Real-time RT-PCR检测的核心设备。需具备多通道荧光检测能力。常用品牌：ABI（现Thermo Fisher）, Bio-Rad, Roche, Qiagen等。
- 电泳仪及成像系统： 用于常规RT-PCR扩增产物的分析（凝胶电泳观察条带）。
- 微量移液器（不同量程）： 精确加样。
- 超纯水系统： 制备实验用水。
病毒分离（若开展）：
- CO2培养箱： 用于细胞培养。
- 倒置显微镜： 观察细胞生长状态和CPE。
- 液氮罐： 保存细胞株和病毒株。
- 恒温水浴锅/金属浴： 用于样本、试剂解冻或保温。
质量控制与生物安全：
- 高压蒸汽灭菌器： 对实验废弃物和器材进行灭菌处理。
- 温度计、湿度计： 监控实验室环境。
- 个人防护装备（PPE）： 包括防护服、口罩（N95或更高）、护目镜/面罩、手套等。