SARSCoV2感染恒河猴模型

选用SPF级2-4岁雄性恒河猴，2.5-3.5kg，来自中国医学科学院医学实验动物研究所（IACUC 批准号：BLL20001）

1. 实验材料

    1.1  SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中国疾控中心谭文杰教授提供。

1.2 实验动物

选用SPF级2-4岁雄性恒河猴，2.5-3.5kg，来自中国医学科学院医学实验动物研究所（IACUC 批准号：BLL20001）

2. 实验环境

所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。

3. 病原培养鉴定

将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）进行分析。

4. 实验操作规程

（1） 感染途径：经气管感染；

（2） 感染剂量：1×10⁶ TCID50 只；

（3） 感染体积：1ml/只；

（4） 对照组：等体积 PBS。

4.3 动物模型分析

（1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重和体温等。

（2）病毒载量：定时收集各组动物脏器，进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。

（4）影像学检查：感染后 0,3,5,7,9,11,13,15天做X-RAY检测。

（5）病理学观察 用新鲜的组织福尔马林固定，制备石蜡切片，用HE，免疫组化或荧光染色，镜下观察。

（6）免疫学检测：感染后第3，4，6，7，11，14天全血进行白细胞、淋巴细胞、单核细胞检查和CD3+,CD4+,CD8+,巨噬细胞，单核细胞，以及血清中特异性抗体。

4.4 数据统计处理方法

所有的数据用GraphPad Prism 6.0 软件分析，感染组小鼠和其他对照组小鼠用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p ＜ 0.05, p＜0.01 或者 #p＜0.05, ##p＜0.01 表示。

1. 表观效度：

我们以体重、体温等来评价模型的症状表型。恒河猴感染模型并无明显临床症状。

2. 结构效度：

感染后第11天检测恒河猴的肺部影像学改变，右肺上叶透亮度减低内可见增粗肺纹理，呈磨玻璃密度改变，水平裂可见，呈细线状。第13天右肺上叶透亮度进一步减低，肺纹理增粗，部分显示不清，水平裂不均匀增厚；左肺上叶肺条理增粗，呈磨玻璃密度改变。第15天时，右肺上叶实变，边缘模糊，内可见支气管像，水平裂增厚；左肺上叶肺条理增粗，呈磨玻璃密度改变，与临床患者影像学相似。病理分析结果显示肺组织呈轻度到重度间质性肺炎，可模拟多数新冠患者的病理表型。另外免疫学的检测结果也与临床患者接近。

3. 预测效度：

目前没有确证有效的阳性药物。