Stat5敲除导致干细胞缺失小鼠模型

在哺乳动物体内，小肠组织是自我更新速度最快的组织之一。整个小肠黏膜大概每3~5d更新一次，主要依赖于小肠干细胞的增殖与分化。研究证实Ascl2、Olfm4、Bmi-1、Hopx等为小肠干细胞的标志基因。在这些标记基因中，Lgr5被认为是最重要的。从功能上分析，Lgr5编码G蛋白偶联受体，在Wnt信号通路中起着重要的作用。从数量上看，Lgr5+干细胞增殖活跃，具有自我更新的潜能，在所有隐窝的底部均大量存在，以维持小肠上皮的稳态。细胞因子- stat5信号通路调控可以调控肠上皮的稳态和损伤反应。我们通过特异性敲除肠道上皮细胞中的STAT5转录因子将STAT5信号通路与IESC的增殖分化联系起来。

实验动物：Stat5 flox小鼠，Villin-CreERT2小鼠

试剂：tamoxifen(50mg/kg)，4%PFA

仪器：冰冻切片机，leica DMI8活细胞工作站

实验操作规程：将Stat5 flox小鼠与Villin-CreERT2小鼠杂交，在小鼠4周龄时，提取杂交小鼠鼠尾DNA，通过凝胶电泳检测小鼠基因型。STAT5基因PCR引物序列如下1. GAA AGC ATG AAA GGG TTG GAG 2.AGC AGC AAC CAG AGG ACT AC  3.AAG TTA TCT CGA GTT AGT CAG G ,Villin-CreERT2基因PCR引物序列如下:1 GTG TGG GAC AGA CAA ACC  2.ACA TCT TCA GGT TCT GCG GG。选取双阳性小鼠，6~8周龄，体重20~22g。按每只小鼠连续5天按50mg/ kg腹腔注射他莫西芬。诱导后CO2麻醉处死小鼠，取肠道组织，用冷PBS冲洗肠道组织，置于4%多聚甲醛中固定过夜，1×PBS溶液里浸泡5min。制作冰冻切片及石蜡切片，免疫组化及免疫荧光染色观察肠道干细胞的变化。

通过FACS分析敲除STAT5基因后干细胞数目明显减少，细胞增殖减少，模型建立成功。