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3.1 实验材料
3.1.1 实验动物
本实验使用SPF级C57BL及ICR小鼠，购买于北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】并在本所SPF级动物屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]中长期饲养繁殖。涉及动物操作程序和动物实验经本所动物使用与管理委员会（IACUC）批准，批准号为BL18003。
3.1.2实验仪器
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仪器及耗材 |
生产厂商 |
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NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 |
日本滨松光子学株式会社 |
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透射电子显微镜 |
JEOL |
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显微注射仪 |
Nikon |
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光学显微镜 |
Nikon |
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化学发光凝胶成像系统 |
BIO-RAD |
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PCR仪 |
BIO-RAD |
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电泳仪 |
BIO-RAD |
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电泳槽 |
Tanon |
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数码凝胶图像处理系统 |
Tanon |
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恒温培养箱
温控振荡箱 |
Incucell
TAITEC |
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离心机 |
Eppendorf |
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摇床 |
SCILOGEX |
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塑料薄膜封口机 |
德清拜杰有限公司 |
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电动鼓风干燥箱 |
天津市泰斯特仪器有限公司 |
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电子称量器（量程0.5g-620g） |
奥豪斯仪器（常州）有限公司 |
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电子称量器（量程0.1mg-220g） |
Sartorius |
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4℃冰箱 |
海尔集团 |
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-80℃冰箱 |
SANYO |
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-20℃冰箱 |
SANYO |
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涡旋振荡器 |
上海沪西分析仪器厂 |
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移液器 |
Eppendorf |
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MRI |
西门子 |
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PET/CT |
西门子 |
3.1.3实验试剂
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试剂 |
生产厂商 |
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体外转录用试剂盒 |
Ambion |
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Taq DNA聚合酶 |
TaKaRa |
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T7 转录试剂盒 |
Invitrogen |
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T4 DNA裂连接 |
TaKaRa |
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胶回收试剂盒 |
Qiagen |
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质粒提取试剂盒 |
Axygen |
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Trizol试剂 |
Invitrogen |
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逆转录试剂盒
DNA提取试剂盒 |
Invitrogen
北京全式金生物科技有限公司 |
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MBP（MAB42282）抗体 |
R&D |
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GADPH |
Santa Cruz Biotechnology |
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NC膜 |
Millipore |
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化学发光液 |
Immuno Cruz |
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蛋白质分子量标记物 |
Takara |
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蛋白酶抑制剂 |
罗氏 |
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组织裂解液 |
Thermo |
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丽春红 |
碧云天 |
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BCA试剂盒 |
碧云天 |
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Western blot 洗液（10×） |
碧云天 |
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30%Acr-Bis |
碧云天 |
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SDS-PAGE电泳液 |
碧云天 |
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Western blot转膜液（粉剂） |
碧云天 |
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TEMED |
碧云天 |
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过硫酸铵 |
碧云天 |
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1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 |
碧云天 |
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1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 |
碧云天 |
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琼脂 |
BD公司 |
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异丙醇 |
北京化工厂 |
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脱脂奶粉 |
内蒙古伊利实业集团股份有限公司 |
3.1.4模型构建流程
利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。
3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立
3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立
（1）设计方案
1，sgRNA 载体
- 载体名称：pUC57-sgRNA expression vector
- Addgene ID: 51132
- 根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基）
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