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黑色素瘤GPR68Ko小鼠皮下移植瘤模型_模型

黑色素瘤GPR68Ko小鼠皮下移植瘤模型_模型项目报价？解决方案？检测周期？样品要求？(不接受个人委托)

发布时间：2023-02-22 18:17:19 点击：

资源中文名称	黑色素瘤GPR68 Ko小鼠皮下移植瘤模型_
资源英文名称	Modle of transplanted melanoma in GPR68 Ko mice
疾病概述	黑色素瘤指有恶性变化的色素斑痣，是由交界痣或混合痣性质的痣发展而来。虽然不一定由斑痣恶变，但是慢性刺激和不恰当的治疗对斑痣转变成黑色素瘤有很大的关系。黑色素瘤表现为黑痣突然出现或迅速长大，色泽不断加深，四周出现彗星状小瘤或色素环，局部发生疼痛、感染、溃疡或出血，出现肿大的淋巴结。肿瘤为单一实性，常有包膜，颜色可黑色、红棕色，深浅程度不一，也可无色素性。大多数黑色素瘤是原发性的，累及成人和儿童，特别是有神经皮肤症状的儿童。肿瘤好发于下肢，其次是头、颈、上肢、眼、指甲下和阴唇等处。早期即能由淋巴道和血行转移至肝、脑、骨、黏膜等处。经常受摩擦的手掌、足底和眼部的黑痣以及位于表皮和真皮交界处的黑痣容易恶变，被认为是黑色素瘤的前驱期。
实验动物背景信息	C57BL/6J小鼠
模型制作方法	包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建/蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。（一）GPR68 Ko小鼠的构建 1、实验设计根据GPR68蛋白保守区和基因组结构，设计需要删除的外显子。GPR68基因存在多种转录产物，但根据GPR68基因组结构和蛋白功能保守区，只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将exon1进行全身性敲除。图2 插入位点设计 2、Cas9/gRNA的活性检测采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测内源活性。根据Cas9/gRNA的内源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。 3、基因敲除小鼠的建立和和品系交配选取活性高的CRISPR体外转录成RNA，显微注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的首建者小鼠（founder）。对小鼠进行基因型鉴定，获得发生期望突变的founder小鼠。通过基因组DNA的PCR进行基因型的鉴定，若发生DNA片段删除，将出现特异的缩短的PCR产物。 4、稳定遗传的Gpr68敲除小鼠品系的建立将带有突变的founder小鼠与野生型小鼠交配，得到基因突变的杂合子小鼠（+/-）F1代，并进行DNA测序，确认目标基因发生的DNA片段删除，从而目标蛋白被失活，实现基因敲除。基因型相同的杂合子小鼠（+/-）相互交配，得到基因敲除的纯合子小鼠（-/-）F2代。大约有1/4几率的F2后代小鼠是基因敲除的纯合体小鼠。（二）皮下移植黑色素瘤模型的构建 1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。 2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×10⁶个/mL，接种体积控制在0.2mL。 3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。 4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b²/2(a为长轴，b为短轴)。 5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量、脾脏重量。
模型表型数据	在无特殊刺激的情况下，GPR68-/-小鼠没有明显表型，且外观与同背景WT小鼠无明显差异。分别从DNA、mRNA、蛋白水平检测GPR68-/-小鼠组织中GPR68表达，如图3所示，在此三个水平上均不能检测到GPR68。图3 鉴定GPR68-/-小鼠组织中GPR68的表达 a.鼠尾DNA的鉴定；b.脾脏T细胞的mRNA鉴定；c.脾脏T细胞的蛋白鉴定分别对WT与GPR68-/-小鼠进行皮下注射接种5×10⁵个B16细胞，观察并检测肿瘤生长情况。接种后第20天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量、脾脏重量。如图4所示，与WT小鼠比较，GPR68-/-小鼠能够明显抑制黑色素瘤的发展，GPR68-/-小鼠脾脏增大，但二者体重无明显差异. 图4 GPR68敲除对黑色素瘤生长的抑制作用 a.小鼠体重曲线；b.肿瘤生长曲线；c.肿瘤大小；d.肿瘤重量；e.脾脏重量