Epha4敲除大鼠模型_【CMA/CNAS认证】_中科光析科学技术研究所

资源中文名称

Epha4敲除大鼠

资源英文名称

SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS

疾病概述

心律失常（arrhythmia）是由于窦房结激动异常或激动产生于窦房结以外，激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导，即心脏活动的起源和（或）传导障碍导致心脏搏动的频率和（或）节律异常。心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病。它可单独发病，亦可与其他心血管病伴发。其预后与心律失常的病因、诱因、演变趋势、是否导致严重血流动力障碍有关，可突然发作而致猝死，亦可持续累及心脏而致其衰竭。遗传性心律失常多为基因通道突变所致，如长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征等。后天获得性心律失常可见于各种器质性心脏病，其中以冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌病、心肌炎和风湿性心脏病多见，尤其在发生心力衰竭或急性心肌梗死时。另有发生在基本健康者或植物神经功能失调患者中的心律失常。其他病因包括电解质或内分泌失调，麻醉，低温，胸腔或心脏手术，药物作用和中枢神经系统疾病等，部分病因不明。

实验动物背景信息

SD大鼠

模型制作方法

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建//蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

仪器及耗材	生产厂商
NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪	日本滨松光子学株式会社
Vevo770小动物超声影像系统	VisualSonics
激光共聚焦扫描显微镜	Leica
透射电子显微镜	JEOL
显微注射仪	Nikon
光学显微镜	Nikon
化学发光凝胶成像系统	BIO-RAD
PCR仪	BIO-RAD
组织脱水机	Leica
石蜡切片机	Leica
石蜡包埋机	Leica
冰冻切片机	Leica
电泳仪	BIO-RAD
电泳槽	Tanon
数码凝胶图像处理系统	Tanon
组织匀浆机	POLYTRON
恒温培养箱温控振荡箱	Incucell TAITEC
离心机	Eppendorf
摇床	SCILOGEX
塑料薄膜封口机	德清拜杰有限公司
电动鼓风干燥箱	天津市泰斯特仪器有限公司
电子称量器（量程0.5g-620g）	奥豪斯仪器（常州）有限公司
电子称量器（量程0.1mg-220g）	Sartorius
4℃冰箱	海尔集团
-80℃冰箱	SANYO
-20℃冰箱	SANYO
涡旋振荡器	上海沪西分析仪器厂
移液器	Eppendorf

3.1.3实验试剂

试剂	生产厂商
体外转录用试剂盒	Ambion
Taq DNA聚合酶	TaKaRa
T7 转录试剂盒	Invitrogen
T4 DNA裂连接	TaKaRa
胶回收试剂盒	Qiagen
质粒提取试剂盒	Axygen
Trizol试剂	Invitrogen
逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒	Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司
Epha4（ab157588）抗体	Abcam
GADPH	Santa Cruz Biotechnology
NC膜	Millipore
化学发光液	Immuno Cruz
蛋白质分子量标记物	Takara
蛋白酶抑制剂	罗氏
组织裂解液	Thermo
丽春红	Beyotime
BCA试剂盒	Beyotime
Western blot 洗液（10×）	Beyotime
30%Acr-Bis	Beyotime
SDS-PAGE电泳液	Beyotime
Western blot转膜液（粉剂）	Beyotime
TEMED	Beyotime
过硫酸铵	Beyotime
1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液	Beyotime
1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液	Beyotime
琼脂	BD公司
异丙醇	北京化工厂
脱脂奶粉	内蒙古伊利实业集团股份有限公司

3.1.4模型构建流程

在Epha4基因的启动子后插入一个报告基因mCherry，造成移码突变，实现基因敲除，制备Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。

3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立

3.1.5.1 Epha4敲除大鼠模型的建立

设计方案

图 1. Epha4敲除模型构建设计方案

构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

CCA GCCTCCGGAGACCTTGAG

R-EPHA4-gRNA UP1 5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC

R-EPHA4-gRNA DOWN1 5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG

靶点2:

CCC GGCGAATGAAGGTAAGAG

R-EPHA4-gRNA UP2 5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC

R-EPHA4-gRNA DOWN2 5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。
构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
显微注射

超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。
受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

基因型鉴定

剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
根据测序结果确定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立

根据3.1.5.1获得Epha4^-/-大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Epha4^-/-与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Epha4^+/-大鼠。之后使8周龄左右Epha4^+/-大鼠进行第二轮杂交，可得到Epha4^-/-大鼠，用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。

加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。
12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。
加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。
将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
重复步骤（5）一次。
加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。
重复步骤（7）一次。
10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。
将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。