pCMV6-XL5-h-SCARB2质粒购自美国Origene公司（Clone ID NM_002257）。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)质粒中巨细胞瘤病毒（CMV）启动子下游，构建全身表达人SCARB2的载体。转基因载体经测序验证后，用Pvu I将载体线性化，Sephedex G50柱纯化。将DNA浓度调整至5 ng/uL，用显微注射法将DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。经鼠尾DNA PCR对首建鼠的基因型进行鉴定，得到阳性首建鼠3只（图1A）。随后，用逆转录PCR分析了首建鼠F1代组织中目的基因的表达情况，发现人SCARB2主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达（图1B）。随后，分别用Western Blot和免疫组化分析了人SCARB2蛋白在脑和骨骼肌组织中的表达情况。由于人SCARB2与小鼠SCARB2同源性较高，存在抗体交叉结合现象。Western Blot发现转基因小鼠脑和骨骼肌组织中SCARB2蛋白表达量高于同窝阴性（图1C-1D）。免疫组化发现SCARB2蛋白主要分布于转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中（图2A-2B），该结果表明成功建立了脑和肌肉组织表达人SCARB2蛋白的转基因小鼠。
图1 人SCARB2转基因小鼠的构建及鉴定注：M：DNA分子质量标准；1-15：首建鼠；NTG：同窝阴性小鼠；TG：转基因小鼠；A：PCR鉴定阳性首建鼠；B：逆转录PCR分析转基因小鼠组织内人SCARB2基因表达；C： Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠脑组织中的表达，GAPDH为内参；D： Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠骨骼肌组织中的表达，GAPDH为内参。
Note: M: DNA molecular weight standard; Lane1-15:Transgenic mouse line; NTG: Negative littermates; TG: Transgenic mice; A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNA as template; B: Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 gene expression in tissues of Tg mice; C: Western blot detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in brain of Tg mice; D: Western blot detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in muscle of Tg mice. The data were normalized to GAPDH expression
Fig.1 Establishment and identification of the transgenic mice expressing human SCARB2.
注： NTG：同窝阴性小鼠；TG：转基因小鼠； A-B：21日龄小鼠脑和肌肉的免疫组；SCARB2蛋白如黑色箭头所示。放大倍数为：100×。
图2 SCARB2转基因小鼠的免疫组化鉴定
Note: NTG: Negative littermates; TG: transgenic mice; A-B: immunohistochemical analysis of brain and muscle of 21-day TG mice and the positions of SCARB2 protein are denoted with black arrows, respectively. Magnification: 100×.
Fig.2 Immunohistochemical identification of the SCARB2 transgenic mice
|
扫一扫，更多精彩