结核猴模型（含耐药结核猴模型）模型

3.1动物的选择

    3周岁以上的健康中国产恒河猴作为实验的研究对象。由于恒河猴在自然条件下也存在一定比例的结核分枝杆菌的感染，为此对进入实验的恒河猴需要进行体检。最主要的一项是进行OT测试。旧结核菌素试验采取猴外眼睑皮内注射的方式，注射0.1mL旧结核菌素。猴麻醉后，在猴的右上眼睑皮内注射旧结核菌素（Colorado Serum Company生产的Tuberculin Mammalian, Human Isolates Intrademic）0.1mL，注射后24h，48h，72h观察实验猴的旧结核菌素反应。

实验前3只恒河猴未出现红肿反应，旧结核菌素反应阴性。

3.2动物的饲养和运输

经OT和X光检测结核阴性的动物可以进入ABSL-3实验室。动物麻醉后正常途径进入。进入负压猴笼饲养。常规猴粮，高压灭菌水，每日饲以半个苹果。温度和湿度以及光照条件为常规ABSL-3实验室条件。

感染后猴子的运输采用专用猴运输箱，操作参考感染猴运送SOP。

3.3结核分枝杆菌的准备

结核分枝杆菌的复苏 从ATCC购买的Erdman菌株（ATCC35810）或结核耐药株（内部编号94789），自-80℃冰箱取出，融化，用7H9液体培养基稀释，分装。取稀释后的Erdman菌液接种L-J培养基斜面，100μL/支，37℃培养3周，菌落长至合适大小。在斜面上加3-4mL 7H9培养基，将菌落自斜面上轻轻刮下，转移至研磨器中，研磨均匀，将研磨好的菌液适当稀释，分装，去一管转接到L-J斜面生长用于菌落计数，其余菌放-80℃冰箱保存备用。

3.4恒河猴的麻醉和复苏

在进行纤支镜和X光检测时由于操作时间较长，需要使用长效麻药复方氯胺酮麻醉动物，用生理盐水1：5稀释麻药，稀释液按照每公斤体重0.1ml的标准肌肉注射麻药，麻醉动物。实验结束后肌肉注射苏醒剂苏醒3号。具体操作参考SOP。

3.5纤维支气管镜的感染操作

动物平放于手术车上，固定四肢。长时间操作需要给动物吸氧。按照纤维支气管镜仪器操作规则，在麻醉动物的齿间放入咬合器，通过咬合器从舌与上腭间插入支气管镜，注意观察监视器，找到声门裂，小心插入支气管镜，进入气管后通过纤支镜给药通道注入2ml利多卡因（注射用）。

继续向下，转入右侧肺至下叶位置。插入感染用纤支镜喷洒导管，感染剂量100CFU。使用5mL注射器推入2mL菌液，之后再推入3mL空气，排尽注射导管内的残余菌液。将纤支镜连同注射管一同取出，进行清洗。清洗程序注射管推入5mL生理盐水，再推入消毒酒精5ml，推入清水5ml，推入生理盐水5ml。取出注射管，纤支镜用生理盐水清洗。

检测感染结核分枝杆菌数量，感染用菌液经L-J斜面培养计数。

3.6动物静脉取血

麻醉动物剪去肘部猴毛，暴露皮肤。酒精面擦拭皮肤表面消毒。5ml注射器静脉采血，取抗凝血和自凝血。分别分离细胞和血清，进行下列血沉、CRP、细胞因子、流式细胞学抗结核抗体等实验。血清分离后冻存于低温冰箱。

3.7动物体温测定

体温芯片的植入：准备好芯片扫描仪,检查是否有电，给体温芯片编号，将芯片录入。麻醉动物后，选择后颈部或上臂近后肩处，酒精棉消毒后，提起皮肤，在皮下植入体温芯片，检查芯片固定的位置，是否脱出，消毒进针口。用芯片扫描一下检验是否正常。

3.8动物的胸部X光检查

检查的头一天晚上实验猴禁水食，检查当天对动物进行麻醉，用数字X光机检查肺部。使用的参数如下：

选择狗的模式，设置参数 高度：64cm，厚度：12cm电压：50kv 电流：1.8~2.4mA之间, 根据猴的大小，固定电压值，调电流。

3.9 CT

检查的头一天晚上实验猴禁水食，检查当天对动物进行麻醉，用数字X光机检查肺部。

在人用的CT机器上选择幼儿参数模式，调节电压和电流使图像分辨率达到要求，如电压为120kv,电流为350mA。设置参数建立三维图, 图像存储为dicom格式，用软件计算病变的体积。

3.10 CRP检测

取全血2ml于血清管中，4℃ 3000rpm离心20min分离血清。血清中C-反应蛋白测定按照MONKEY C-REACTIVE PROTEIN(CRP) ELISA TEST KIT说明书进行操作，结果以ng/ml表示。具体步骤为：按要求重悬标准品后，依次稀释成75ng/ml，37.5 ng/ml，18.75 ng/ml，9.38 ng/ml，4.69 ng/ml，2.34 ng/ml，1.17 ng/ml和0 ng/ml。将各浓度的标准品和1:1000稀释后的动物血清分别加至已包被抗体的96孔板中，100ul/孔。室温孵育45min，洗板后每孔加HRP标记的检测抗体100ul。室温孵育45min后，洗板，加TMB 100ul/孔进行显色。室温避光显色20min后加终止液，于450nm处读取OD值。根据标准曲线计算每只动物感染后不同时间点时血清中的C-反应蛋白含量。

3.11血沉检测

恒河猴麻醉后，取全血1.6ml于柠檬酸钠抗凝的血沉管中，颠倒混匀5—8次，垂直插在血沉架上，将血沉管血液的液面与血沉架上的0刻度线对齐，室温静置1h后观察红细胞下降的mm数。

3.12血清中结核抗体（IgG）的检测

    按照结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒（胶体金法）使用说明书进行操作：将试剂和反应板取出平衡至室温，反应板上依次标号。在每个反应孔中加2滴封闭液，待吸收完全后分别加入分离的血清各40ul，之后每孔加入洗涤液各6滴，待吸收完全后每孔加2滴金标液进行显色。最后每孔加入6滴洗涤液，待吸收完全后目测结果。结果的判定以质控点和反应孔中间同时出现红色斑点为阳性，若质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点出现或仅为痕迹者为阴性。