猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测概述

猪瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一种高度接触性、致死性传染病，对全球生猪养殖业构成严重威胁。该病毒可通过直接接触、污染物或垂直传播扩散，感染后表现为高热、出血性病变及高死亡率，具有极强的经济破坏性。传统诊断方法如病毒分离、血清学检测等存在耗时长、灵敏度低等局限，而实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（Real-time RT-PCR）凭借其快速、高灵敏度、特异性强等优势，成为当前CSFV检测的核心技术。该方法能够实现病毒核酸的精准定量，适用于疫情监测、疫苗效果评估及早期预警，为猪瘟防控提供科学支撑。

检测项目

实时荧光RT-PCR检测的核心目标包括：
1. 病原体检测：直接检测临床样本（如血液、脾脏、淋巴结）中的CSFV特异性核酸片段，确认感染状态。
2. 病毒分型：通过靶向病毒基因组的保守区域（如5'UTR、E2基因），区分野毒株与疫苗株（如C株疫苗），为流行病学溯源提供依据。
该检测项目适用于生猪养殖场、屠宰场、出入境检疫及实验室研究等多个场景。

检测仪器

完成检测需配套以下关键仪器：
- 实时荧光PCR仪（如ABI 7500、Bio-Rad CFX96）：用于核酸扩增与荧光信号实时监测。
- 核酸提取仪（如Qiagen QIAcube）：自动化提取病毒RNA，提高检测效率。
- 高速离心机：用于样本预处理及试剂离心混匀。
- 超净工作台：保障核酸提取与扩增体系配置的无污染环境。
- 微量移液器及配套耗材：确保试剂分装的精准性。
- 生物安全柜：高风险样本操作时的生物安全防护。

检测方法

检测流程分为以下关键步骤：
1. 样本采集与处理：采集病猪全血、脾脏或扁桃体等组织，匀浆后离心取上清液。
2. 病毒RNA提取：使用商业化RNA提取试剂盒（如TRIzol法或磁珠法），DNase处理去除基因组DNA干扰。
3. 引物与探针设计：针对CSFV基因组保守区设计特异性引物及TaqMan探针（如FAM标记探针，淬灭基团为BHQ1）。
4. RT-PCR反应体系配置：采用一步法试剂盒，包含反转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs及缓冲液，反应体积通常为25μL。
5. 扩增程序设置：50℃反转录15分钟，95℃预变性10分钟，随后进行40个循环的95℃ 15秒、60℃ 1分钟。
6. 结果分析：通过荧光阈值（Threshold）判定Ct值，Ct≤35为阳性，35＜Ct＜40需复检，阴性对照无扩增曲线。

检测标准

检测过程需严格遵循以下标准：
- 国际标准：世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中CSFV分子检测指南。
- 国家标准：GB/T 36872-2018《猪瘟病毒荧光RT-PCR检测方法》。
- 行业规范：农业农村部《猪瘟防治技术规范》中实验室检测要求。
- 质量控制：每批次检测需包含阳性对照（CSFV标准品）、阴性对照（无核酸水）及内标（如β-actin），确保检测体系可靠性。

结语

实时荧光RT-PCR技术通过精准的核酸扩增与实时监测机制，极大提升了猪瘟病毒检测的时效性与准确性，成为疫情防控的关键工具。检测过程中需严格遵守标准操作程序（SOP），结合仪器校准、环境控制和人员培训，确保结果的可重复性与国际可比性。未来，随着数字PCR等新技术的应用，CSFV检测将向更高灵敏度与绝对定量方向发展，为猪瘟净化提供更强技术保障。

检测机构资质证书

CMA认证

检验检测机构资质认定证书

证书编号：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS认可

实验室认可证书

证书编号：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO认证

质量管理体系认证证书

证书编号：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

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