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卫生指标（铜绿假单胞菌）检测

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发布时间：2025-06-04 00:11:40 更新时间：2025-06-10 00:09:53

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

卫生指标（铜绿假单胞菌）检测概述

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种广泛存在于水、土壤、植物及动物体表的机会性致病菌。因其对多种抗生素具有天然或获得性耐药性，且在潮湿环境中极易繁殖并形成生物膜，使其成为医疗环境、制药、食品、饮用水及化妆品等行业中重要的卫生指标菌。该菌对免疫功能低下或受损人群（如烧伤患者、囊性纤维化患者）具有高度致病性，可引起严重的感染（如肺炎、败血症、伤口感染）。因此，建立准确、可靠的铜绿假单胞菌检测方法对保障公共卫生安全、产品质量控制及控制医院感染至关重要。

检测项目

铜绿假单胞菌作为关键卫生指标菌，其检测项目主要针对特定环境或产品中该菌的定性或定量分析：

定性检测： 确认样品中是否存在铜绿假单胞菌（检出/未检出）。
定量检测： 测定单位体积（如mL水）或单位重量（如g食品）样品中所含铜绿假单胞菌的数量，通常以菌落形成单位（CFU）表示。
特定基质检测： 针对不同样品类型（如饮用水、包装饮用水、非无菌药品/化妆品、医疗器械冲洗液、食品等）制定相应的检测方案。

主要检测仪器

进行铜绿假单胞菌检测通常需要以下核心仪器设备：

生物安全柜/超净工作台： 提供无菌操作环境，防止样品污染和环境释放。
恒温培养箱： 用于样品在特定温度（如36±1℃, 41.5±1℃）下的培养。
高压蒸汽灭菌锅： 对培养基、玻璃器皿、实验废弃物进行灭菌。
水浴锅/干浴器： 用于融化固体培养基或维持液体培养基温度。
膜过滤装置： 用于液体样品（如饮用水、大容量注射剂）的过滤富集。
均质器/拍打式均质袋： 用于固体或半固体样品（如食品、软膏）的均质处理。
pH计： 调整培养基pH值。
菌落计数器/自动菌落计数仪： 用于菌落数的统计。
显微镜及配套设备： 用于初步观察菌体形态。
生化鉴定系统/微生物鉴定仪 (可选)： 用于菌株的自动化生化鉴定。
PCR仪及相关设备 (分子生物学方法)： 用于基于核酸的快速检测或确证。

检测方法

铜绿假单胞菌的检测通常遵循基于培养的标准方法，可分为以下几个关键步骤：

样品前处理：
- 液体样品： 可直接检测或经膜过滤富集。
- 固体/半固体样品： 需用无菌稀释液（如缓冲蛋白胨水BPW, 生理盐水）进行均质制成悬液。
增菌培养 (必要时)：
- 对于含菌量可能较低或存在损伤菌的样品，使用非选择性增菌肉汤（如乙酰肉汤）进行预增菌。
选择性分离：
- 将处理后的样品或增菌液划线接种于选择性固体培养基上。最常用的培养基是：
  - 溴化十六烷基三甲铵琼脂 (Cetrimide Agar)： 铜绿假单胞菌能生长并产生特征性的蓝绿色色素（绿脓菌素）和黄绿色荧光（绿脓荧光素）。其他革兰氏阴性菌在此培养基上通常受到抑制。
- 也可使用其他选择性培养基如假单胞菌CN琼脂(Pseudomonas CN Agar)。
- 接种后的平板在36±1℃下倒置培养18-48小时。
菌落观察与初步鉴定：
- 观察平板上生长的菌落：在Cetrimide琼脂上，典型铜绿假单胞菌菌落通常呈扁平、边缘不规则、表面湿润有光泽，产生扩散性蓝绿色色素（绿脓菌素）和/或黄绿色荧光（绿脓荧光素）。
- 挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检（应为革兰氏阴性杆菌）和氧化酶试验（阳性）。
确认试验：
- 对初步鉴定为可疑铜绿假单胞菌的菌株，需进一步进行生化试验验证：
  - 氧化酶试验： 阳性（关键指标）。
  - 42℃生长试验： 能在41.5±1℃下生长（区别于多数其他假单胞菌）。
  - 乙酰胺利用试验： 能利用乙酰胺作为唯一碳氮源（常用确证试验）。
  - 绿脓菌素测试： 确证色素产生。
  - 其他辅助试验（如明胶液化、精氨酸双水解酶等）。
- 也可使用商品化的鉴定系统（如API 20NE， Vitek 2）或分子生物学方法（如PCR检测特定基因）进行快速准确鉴定。

检测标准

铜绿假单胞菌的检测必须依据国家、国际或行业颁布的权威标准方法进行，以确保结果的可靠性和可比性。主要标准包括：

ISO 16266:2006 Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration: 国际标准化组织制定的水中铜绿假单胞菌检测金标准方法（膜过滤法）。
ISO 16266-2:2018 Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Part 2: Most probable number method: 水中铜绿假单胞菌检测的MPN法标准。
GB 8538-2022 食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法: 中国国家标准，明确规定了饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌的检验方法（基于膜过滤和CN琼脂）。
GB 4789.28-2013 食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求: 对检测中使用的培养基进行质量控制。
《中华人民共和国药典》 (ChP): 通则1105、1106、1107等规定了对非无菌产品（如滴眼液、吸入制剂、创面敷料）中铜绿假单胞菌的检查方法（通常包括增菌、选择性分离和确证试验流程）。
《化妆品安全技术规范》: 规定了对化妆品中铜绿假单胞菌的检测方法。
USP <62> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms: 美国药典对非无菌产品中特定微生物（包括铜绿假单胞菌）的检查方法。
EP 2.6.13 Microbiological examination of non-sterile products: test for specified micro-organisms: 欧洲药典的相关规定。