凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其它种）检测

凝固酶阳性葡萄球菌，尤其是其中的金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*），是重要的食源性致病菌和医疗相关感染的主要病原体之一。它们广泛存在于环境、人体皮肤和鼻腔中，能够产生多种毒素（如肠毒素、溶血毒素）和侵袭性酶（如凝固酶、耐热核酸酶）。摄入被金黄色葡萄球菌肠毒素污染的食物会导致急性食物中毒，表现为剧烈呕吐、腹泻等症状。此外，金黄色葡萄球菌也是皮肤软组织感染、肺炎、败血症、心内膜炎和中毒性休克综合征等严重疾病的重要病因。某些凝固酶阳性的非金黄色葡萄球菌（如施氏葡萄球菌凝聚亚种、中间葡萄球菌等）也被证明具有致病潜力，尤其在动物和人类机会性感染中。因此，准确、及时地检测和鉴定食品、环境样本、临床标本中的凝固酶阳性葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌，对于保障食品安全、控制医院感染和指导临床治疗具有极其重要的意义。

检测项目

凝固酶阳性葡萄球菌检测的核心目标包括：

• 定性检测：确定样品中是否存在凝固酶阳性葡萄球菌（主要是金黄色葡萄球菌）。
• 定量检测：测定样品（如食品）中凝固酶阳性葡萄球菌（主要是金黄色葡萄球菌）的数量（通常以 CFU/g 或 CFU/mL 表示）。
• 鉴定：将检出的凝固酶阳性葡萄球菌进一步鉴定到种（如区分金黄色葡萄球菌与其他凝固酶阳性葡萄球菌）。
• 特定毒素检测：有时需要额外检测金黄色葡萄球菌是否产生肠毒素（SEs）或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）相关的 mecA/mecC 基因。

检测仪器

检测过程中可能使用到以下仪器设备：

• 基础实验室设备：生物安全柜（用于无菌操作）、恒温培养箱（用于样本孵育）、恒温水浴锅（用于凝固酶试验）、冰箱/冰柜（用于培养基和试剂保存）、高压蒸汽灭菌器（用于器材灭菌）、天平、均质器/拍击式均质袋（用于样品前处理）。
• 分离与计数设备：接种环/针、涂布棒、菌落计数器（用于平板菌落计数）。
• 生化鉴定设备：显微镜（用于形态观察）、生化鉴定管或微量生化反应板、药敏试验系统。
• 分子生物学仪器（用于快速鉴定或毒素/耐药基因检测）：PCR仪、实时荧光定量PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统。
• 自动化/快速检测系统：如基于免疫学方法（ELISA、胶体金试纸条）或分子生物学（如恒温扩增）的快速检测试剂盒及其配套读取设备；全自动或半自动微生物鉴定及药敏分析系统（如VITEK, BD Phoenix, MALDI-TOF MS）。

检测方法

检测方法主要包括传统培养法和快速检测法：

1. 传统培养法（标准方法）：
   • 前处理与增菌：样品经无菌均质后，根据检测目的（定性或定量）选择直接涂布或先进行选择性增菌（如使用7.5%氯化钠肉汤或BHI肉汤）。
   • 分离培养：增菌液或均质液划线接种到选择性平板（最常用Baird-Parker琼脂平板，典型菌落为圆形、黑色、边缘光滑湿润、外围有一混浊带和透明圈）。也可使用血琼脂平板（观察溶血环）或显色培养基（如金黄色葡萄球菌显色平板）。
   • 纯培养与初步鉴定：挑取典型或可疑菌落进行纯培养，进行革兰氏染色（观察革兰氏阳性球菌，葡萄状排列）、触酶试验（阳性）。
   • 凝固酶试验（关键鉴定试验）：这是区分凝固酶阳性（致病性强）和凝固酶阴性葡萄球菌的核心试验。
     • 玻片法（结合凝固酶试验）：检测菌体表面结合的凝固酶，快速但存在假阳性和假阴性，需试管法确证。
     • 试管法（游离凝固酶试验）：将纯培养菌落接种于含兔血浆（含EDTA抗凝剂）的试管中，置于37°C水浴或培养箱中孵育。观察4小时和24小时。阳性结果：血浆凝固成胶冻状，即使试管倒置或倾斜也不会流动。阴性结果：血浆保持液态。试管法是鉴定凝固酶阳性葡萄球菌的“金标准”之一。
   • 耐热核酸酶试验：常作为金黄色葡萄球菌的辅助鉴定指标（大多数金葡菌阳性）。
   • 定量计数：选择合适的稀释度，涂布于选择性平板（如Baird-Parker），计数典型菌落，并确证凝固酶阳性，计算样品中的含量。
   • 进一步鉴定：对于凝固酶阳性的菌株，可通过API Staph、VITEK GP卡等生化鉴定系统或MALDI-TOF MS质谱技术鉴定到种。
2. 快速检测法：
   • 免疫学方法：利用金黄色葡萄球菌特异性抗体（如针对蛋白A、肠毒素或表面抗原）进行检测，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、侧向层析免疫试纸条（胶体金法），主要用于初筛或肠毒素检测。
   • 分子生物学方法：主要是PCR及实时荧光定量PCR技术，通过扩增金黄色葡萄球菌特异性基因片段（如耐热核酸酶基因 *nuc*、23S rRNA基因片段或其他特异性标记基因）进行快速、灵敏的定性或定量检测。也可用于检测肠毒素基因（*sea, seb*等）或mecA/c基因（鉴定MRSA）。
   • 自动化仪器法：如全自动微生物鉴定系统（利用生化反应）或MALDI-TOF MS（利用蛋白质指纹图谱）可在更短时间内提供鉴定结果。

检测标准

国内外针对凝固酶阳性葡萄球菌（主要是金黄色葡萄球菌）的检测制定了多项标准，以保证检测的准确性和可比性：

• 中国国家标准 (GB)：
  • GB 4789.10-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》：这是国内食品检测的权威标准，详细规定了食品中金黄色葡萄球菌的定性（包括增菌法）和定量（平板计数法）检测程序、培养基、鉴定步骤（包括凝固酶试验）及结果报告。
  • GB/T 7918.5-1987 《化妆品微生物标准检验方法 金黄色葡萄球菌》：规定了化妆品中金黄色葡萄球菌的检验方法。（注：可能有更新版本或将被新国标替代）。
  • 临床检验领域：遵循卫生行业标准或由权威机构（如中华医学会检验分会）发布的指南，对临床标本（如血液、脓液、分泌物）中的金黄色葡萄球菌进行检测和药敏试验。
• 国际标准 (ISO)：
  • ISO 6888-1:2021 《Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (*Staphylococcus aureus* and other species) -- Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium》：规定了使用Baird-Parker琼脂进行凝固酶阳性葡萄球菌计数的国际标准方法。
  • ISO 6888-2:2021 《... Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium》：规定了使用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基的计数方法。
  • ISO 6888-3:2003 《... Part 3: Detection and MPN technique for low numbers》：规定了低数量时凝固酶阳性葡萄球菌的检测和最可能数（MPN）技术。
  • ISO 22718:2015 《Cosmetics -- Microbiology -- Detection of *Staphylococcus aureus*》：规定了化妆品中金黄色葡萄球菌检测的国际标准方法。
• 美国食品药品监督管理局 (FDA) / 美国分析化学家协会 (AOAC)

  检测机构资质证书

  

  CMA认证

  检验检测机构资质认定证书

  证书编号：241520345370

  有效期至：2030年4月15日

  

  CNAS认可

  实验室认可证书

  证书编号：CNAS L22006

  有效期至：2030年12月1日

  

  ISO认证

  质量管理体系认证证书

  证书编号：ISO9001-2024001

  有效期至：2027年12月31日