蚯蚓（如赤子爱胜蚓 Eisenia fetida）作为土壤生态毒理学的重要指示生物，其急性毒性试验用于评估化学品、农药或污染物对土壤生物的短期致死效应。以下是基于 OECD 207、ISO 11268-1 及 GB/T 31270.10-2014 的标准化试验流程：
一、试验生物与材料
- 蚯蚓选择：
- 推荐种：赤子爱胜蚓（成年，体重300~600mg，环带明显）；
- 来源：实验室培养≥2个月的健康种群，试验前饥饿24小时。
- 试验土壤：
- 人工土壤：10%泥炭、20%高岭土、70%石英砂（粒径0.1~0.5mm），pH 6.0±0.5，含水率35%（干重基准）。
二、试验设计
- 受试物处理：
- 水溶性物质：溶解于去离子水后混入土壤；
- 难溶物质：与石英砂预混合，确保均匀分布。
- 浓度梯度设置：
- 按几何级数设置5~7个浓度组（如1000、500、250 mg/kg干土），含空白对照及溶剂对照（若使用助溶剂，如丙酮≤0.1%）。
三、试验操作流程
- 暴露设置：
- 每组10条蚯蚓，置于1kg人工土壤中（容器直径≥15cm，高度≥10cm）；
- 温度：20±2℃，黑暗条件（避光），湿度维持35%±5%。
- 观察与记录：
- 时间：暴露后24h、48h、72h、14天（OECD标准为14天）；
- 指标：
- 死亡率：无运动反应（轻触无收缩）、体节断裂；
- 异常行为：体表黏液分泌异常、逃避反应消失。
四、数据计算与判定
- LC₅₀计算：
- 使用Probit法、Trimmed Spearman-Karber法或软件（如EPA Probit Analysis Program）；
- 报告14天-LC₅₀（mg/kg干土）及95%置信区间。
- 有效性标准：
- 对照组死亡率≤10%；
- 土壤pH波动≤±0.5单位，含水率变化≤±5%。
五、国际与国内标准限值
| 毒性分级 |
14天-LC₅₀（mg/kg干土） |
典型污染物举例 |
| 剧毒 ≤10 |
五氯酚、呋喃丹 |
|
| 高毒 10~100 |
镉（Cd²⁺）、毒死蜱 |
|
| 中毒 100~1000 |
苯并[a]芘、阿特拉津 |
|
| 低毒 >1000 |
草甘膦（部分制剂） |
|
六、质量控制要点
- 土壤均一性：确保受试物与土壤混合均匀（机械搅拌≥10分钟）；
- 避光控制：全程黑暗条件，避免光解或蚯蚓避光行为干扰；
- 温湿度稳定：使用恒温箱，每日补水（称重法校准湿度）。
七、常见问题与解决方案
| 问题 |
原因分析 |
优化措施 |
| 高背景死亡率 |
土壤pH异常或重金属污染 |
预试验检测土壤本底值，更换合格人工土壤 |
| 受试物吸附损失 |
有机质吸附或挥发导致浓度降低 |
使用低有机质人工土壤，半静态法更新土壤 |
| 蚯蚓逃逸 |
容器密封不严或土壤不适 |
容器顶部加盖透气滤膜，确保土壤湿度适宜 |
| 数据离散性大 |
蚯蚓个体差异或混合不均 |
严格筛选同龄健康蚯蚓，机械混匀受试物 |
八、试验报告内容
- 受试物信息（名称、纯度、配制方法）；
- 蚯蚓来源、年龄、体重范围及驯养条件；
- 试验设计（浓度梯度、土壤参数、温湿度）；
- 死亡率数据、LC₅₀计算过程及统计方法；
- 质量控制参数（pH、湿度、对照组成活率）；
- 结论与毒性分级建议。
通过标准化的蚯蚓急性毒性试验，可为化学品土壤生态风险评估提供关键数据。建议结合慢性试验（如繁殖抑制试验，ISO 11268-2）及回避行为测试（ISO 17512-1）全面评估污染物对土壤生态系统的长期影响。
