非洲猪瘟检测_【CMA/CNAS认证】_中科光析科学技术研究所

非洲猪瘟（African Swine Fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的猪类烈性传染病，具有高致死率（急性型死亡率可达100%）和快速传播特点。其检测需围绕 病毒核酸、抗原及抗体 等靶标展开，结合 现场快速筛查 与 实验室确诊，确保疫情早发现、早处置。以下是基于 OIE《陆生动物诊断试验手册》、GB/T 18648-2020（非洲猪瘟诊断技术）》 及 农业农村部应急监测指南 的系统化检测方案：

一、核心检测技术与应用场景

检测靶标	检测方法	技术特点	适用阶段
病毒核酸	实时荧光定量PCR（qPCR）	高灵敏度（Ct≤38）、特异性强，可区分基因型	早期感染、疑似病例确诊
病毒抗原	免疫层析试纸条（抗原检测）	快速（15分钟出结果）、无需设备，适合现场筛查	屠宰场/养殖场初步排查
病毒抗体	ELISA（间接法/阻断法）	高通量、适合群体抗体监测，感染后7~14天可检出	康复猪追溯、流行病学调查
全基因组测序	二代测序（NGS）	精准溯源、分析变异位点（如EP402R基因缺失）	疫情溯源、毒株分型研究

二、样本采集与处理规范

样本类型	采集部位	保存与运输	检测优先级
全血/血清	前腔静脉采血（EDTA抗凝）	4℃保存（24小时内送检），-80℃长期保存	抗体检测（ELISA）
脾脏/淋巴结	病变最明显部位（暗红色肿大）	置于50%甘油-PBS中，冰袋运输（避免反复冻融）	核酸检测（qPCR）首选
口鼻拭子	口腔分泌物或鼻腔刮取物	病毒保存液中混匀，4℃保存（72小时内检测）	活体猪筛查（抗原试纸条）
环境样本	车辆、饲料、水源、土壤等	拭子擦拭后浸入缓冲液，低温运输（避免阳光直射）	污染源追踪（qPCR）

三、标准化检测流程

1. 现场快速筛查（抗原试纸条）

样本处理：
- 取脾脏/淋巴结匀浆液（PBS 1:5稀释）→ 离心取上清；
- 口鼻拭子直接浸入裂解液，静置5分钟。
检测操作：
- 滴加3~4滴上清液至试纸条加样孔→ 15分钟内判读结果；
- 阳性：C线+T线均显色；阴性：仅C线显色。
注意事项：
- 避免高温/潮湿环境操作，假阳性率≤5%（需实验室复核）。

2. 实验室确诊（qPCR）

核酸提取：
- 采用磁珠法（如QIAamp Viral RNA Kit）提取病毒DNA；
- 阳性对照（ASFV P72基因质粒）+阴性对照（DEPC水）。
qPCR扩增：
- 引物探针（OIE推荐）：
  - 正向引物：5'-ATGGCACGGTATCGACAACT-3'
  - 反向引物：5'-CTTTGCTGCTGTTCGAGGA-3'
  - 探针：FAM-CCACGGGAGGAATACCAAC-BHQ1
- 反应体系：95℃预变性2min → 95℃ 15s → 60℃ 1min（45循环）。
结果判定：
- 阳性：Ct≤38且扩增曲线呈S型；可疑：38<Ct≤40，需复检；
- 阴性：Ct>40或无扩增。

3. 抗体检测（ELISA）

包被抗原：重组ASFV P54/P30蛋白；
操作步骤：
- 血清1:40稀释 → 加样→ 37℃孵育1h → 洗板→ 加酶标二抗→显色；
判定值：
- S/P值（样本OD/阳性对照OD）≥0.5判为阳性（间接ELISA）。

四、生物安全与阳性处置

实验室要求：
- ASFV检测需在 BSL-3实验室 进行，废弃物高压灭菌（121℃×30min）；
阳性处置：
- 立即启动 农业农村部ASF疫情应急预案，划定疫点（发病猪舍）、疫区（半径3km）及受威胁区（半径10km）；
- 扑杀疫点内所有猪只 → 无害化处理（深埋/焚烧）→ 全面消毒（次氯酸钠≥2000mg/L）；
监测解除：
- 疫点消毒后空栏42天 → 环境样本连续3次qPCR阴性 → 解除封锁。

五、国际标准与前沿技术

技术/标准	核心内容	应用场景
OIE标准	要求成员国24小时内上报疫情，采用qPCR或病毒分离为确诊依据	跨境贸易、疫情通报
CRISPR-Cas检测	基于Cas12a的侧流层析技术（1小时内完成），灵敏度达10 copies/μL	现场快速诊断（无需PCR仪）
数字PCR（dPCR）	绝对定量病毒载量，适合低浓度样本（如康复猪排毒监测）	精准防控、净化评估

通过系统化检测与防控，可有效阻断非洲猪瘟传播链。建议养殖场建立 常态化监测机制（每月随机抽样qPCR筛查），并采用 全进全出 管理模式降低风险。检测机构需定期参加 OIE或CNAS能力验证，确保结果可靠性。对于疑似病例，务必遵循 “早、快、严、小” 原则，避免疫情扩散。