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大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌检测

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发布时间：2025-05-10 07:25:26 更新时间：2025-06-09 21:22:46

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌检测技术

检测的重要性和背景介绍

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是两种危害严重的土传病原真菌，在全球范围内对农作物造成重大经济损失。这两种病原菌能够侵染包括棉花、番茄、马铃薯、瓜类等200多种经济作物，引起维管束萎蔫病和根腐病等系统性病害。由于它们能在土壤中长期存活(5-10年)，并通过灌溉水、农机具等途径传播，防控难度极大。准确及时的检测对病害早期预警、制定防控策略以及培育抗病品种都具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的发展，基于PCR、LAMP等核酸扩增技术的检测方法显著提高了检测灵敏度和特异性，为植物检疫和病害防控提供了有力工具。

具体的检测项目和范围

本检测项目主要针对：1) 土壤样本中两种病原菌的定性和定量检测；2) 植物组织(根、茎)中的病原菌侵染诊断；3) 种子带菌检测；4) 灌溉水等传播介质的病原菌监测。检测范围覆盖菌丝体、微菌核(大丽轮枝菌)和厚垣孢子(尖孢镰刀菌)等各种生存形态，检测灵敏度要求达到1-10个孢子/克土壤的水平。对于进出口检疫，还需区分特定致病型，如尖孢镰刀菌的专化型(f.sp.)鉴定。

使用的检测仪器和设备

检测主要使用以下设备：1) 实时荧光定量PCR仪(如ABI 7500)用于特异性核酸片段扩增和定量；2) 凝胶电泳系统验证扩增产物；3) 生物显微镜(400-1000倍)用于形态学观察；4) 恒温培养箱用于传统分离培养；5) 超净工作台保证无菌操作；6) 离心机、涡旋振荡器等样品前处理设备。分子检测需配备-20℃和-80℃冰箱保存试剂和核酸样本，传统培养法需要高压灭菌锅和干燥箱等设备。

标准检测方法和流程

检测采用三级递进式方法：

1) 形态学鉴定：采用选择性培养基(如Komada's培养基)分离培养，观察菌落形态(大丽轮枝菌产生黑色微菌核，尖孢镰刀菌产生镰刀状大分生孢子)；

2) 分子检测：提取样本总DNA后，采用特异性引物进行PCR扩增。大丽轮枝菌常用引物对VDS1/VDS2扩增ITS区域，尖孢镰刀菌使用FOF1/FOR1引物扩增TEF-1α基因片段。实时荧光定量PCR可采用TaqMan探针提高特异性；

3) 致病性测定：对阳性分离物进行寄主接种试验，确认致病性。检测流程包括：样品采集→预处理→DNA提取→PCR扩增→电泳分析→序列验证(必要时)→数据判读。每个批次需设置阳性对照(标准菌株)和阴性对照(无菌水)。

检测结果的评判标准

检测结果分三级判定：1) 阴性：培养法未检出目标菌落，PCR无特异性条带，Ct值≥40；2) 阳性：培养法检出典型菌落且分子验证通过，或PCR出现预期条带且Ct值<35，测序相似度≥98%；3) 可疑：PCR Ct值35-40需重复检测确认。定量检测时，土壤中>100个孢子/克为高风险，10-100个为中风险，<10个为低风险。对于检疫样品，检出活体病原菌即为不合格。检测报告应包含检测方法、阈值设定、质控结果等完整信息。