重度哮喘小鼠模型是以卵白蛋白、屋尘螨提取物或呼吸道合胞病毒等致敏激发建立的评价支气管哮喘重度表型的实验载体，其检测覆盖气道反应性、肺泡灌洗液炎症细胞分类、IL-17A等炎症因子水平、气道病理形态、相关基因与蛋白表达以及Th17/Treg免疫分型等多个维度。系统的模型检测可用于验证建模成功与否，也为抗炎药物、气道重塑干预及机制研究的后续评价提供量化指标。以下按样品采集与各检测模块分述。
重度哮喘小鼠模型检测概述
重度哮喘小鼠模型的检测围绕表型确认与机制评价两条主线展开。表型确认依赖气道高反应性测定、肺泡灌洗液中性粒细胞与嗜酸性粒细胞计数、HE与PAS染色显示的气道炎症及黏液分泌程度；机制评价则涵盖TLR4/MyD88/NF-κB等信号通路分子、IL-17A、NGF/TrkA、LOXL2、组织蛋白酶S等靶点的基因与蛋白水平检测，以及Th17/Treg细胞平衡的流式分析。多数哮喘模型研究以BALB/c或C57BL/6小鼠为对象，检测方案应结合致敏途径与观察终点合理选取。
模型样本类型与采集方案
常见样本支气管肺泡灌洗液、肺组织、外周血血清及脾脏、纵隔淋巴结单个核细胞。肺泡灌洗液于麻醉后暴露气管，以预冷磷酸盐缓冲液分段灌洗回收，一部分离心取细胞沉淀用于分类计数，上清用于细胞因子检测；肺组织分三路处理，一部分以多聚甲醛固定供病理染色与免疫组化，一部分液氮速冻供RNA及蛋白提取，剩余部分经酶消化制备单细胞悬液用于流式检测。采集时间点应与末次激发间隔相衔接，避免炎症峰值错位影响结果判读。
气道反应性测定——雾化激发法
气道高反应性是重度哮喘模型成立的核心功能性指标，常规采用有创体描术或无创整体体积描记法，以梯度浓度乙酰甲胆碱雾化激发，记录气道阻力或Penh值的变化曲线，以剂量反应关系判断气道反应性增高程度。操作要点：激发前基础值稳定记录、各浓度梯度之间设置平衡间期、对照组与模型组在同一条件下平行测定。有创法可区分气道阻力与肺顺应性，数据更接近力学本质；无创法适用于清醒动物纵向随访，两者可按实验周期互补选用。
肺泡灌洗液炎症细胞分类计数
灌洗液细胞学分析直接反映气道炎症的细胞类型构成。沉淀细胞经涂片或细胞甩片后行Diff-Quik或瑞氏-吉姆萨染色，分类计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞与巨噬细胞比例。重度哮喘模型常表现为中性粒细胞与嗜酸性粒细胞混合增多，混合粒细胞型表型还需结合细胞因子谱加以界定；组织蛋白酶S、免疫蛋白酶体等分子的干预研究亦以此计数作为主要疗效读出指标。计数应保证每张涂片足够的细胞总量，并由双人盲法复核，以降低分类主观性带来的偏差。
炎症因子ELISA检测——IL-17A等
肺组织匀浆上清、灌洗液及血清中的细胞因子水平采用双抗体夹心ELISA法测定，常见指标IL-17A、IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、IL-6及TNF-α。操作流程为：包被抗体孵育、加样、酶标二抗结合、底物显色后于酶标仪读取吸光度，依据标准曲线拟合计算浓度。IL-17A与中性粒细胞性炎症及Th17应答密切相关，是重度哮喘模型分型的关键指标；样品需注明匀浆蛋白定量归一方式，避免组织取样量差异干扰组间比较。试剂盒应按批内批间差异控制要求平行复孔测定。
HE与PAS染色评估气道炎症
石蜡切片经苏木精-伊红染色后，依据支气管周围及血管周围炎性细胞浸润程度行半定量评分，评估气道炎症等级。过碘酸雪夫染色使气道上皮黏蛋白中的糖类成分着色，用于量化杯状细胞增生与黏液分泌，也可结合AB-PAS染色区分酸性及中性黏多糖。气道重塑评价可辅以Masson三色染色显示胶原沉积，配合α-SMA免疫组化判断上皮下纤维化与平滑肌增厚，LOXL2等重塑相关靶点研究多采用该组合。阅片应采用盲法，每只动物选取同等级别的支气管断面以保证可比性。
实时荧光PCR检测基因表达
肺组织中目的基因mRNA表达采用实时荧光定量PCR测定，流程为TRIzol法提取总RNA、逆转录合成cDNA、SYBR Green或TaqMan探针法扩增，以2^-ΔΔCt法计算相对表达量。常用靶基因涵盖IL-17A、RORγt、Foxp3、TLR4、MyD88、NF-κB p65、MUC5AC、LOXL2及Vimentin等，分别对应炎症分型、固有免疫通路、黏液分泌与上皮-间质转化评价。引物须跨外显子设计以规避基因组DNA干扰，熔解曲线单一峰为特异性判据；内参基因应预先验证稳定性。microRNA差异表达分析可结合茎环引物逆转录开展。
Western blot与免疫组化蛋白检测
蛋白水平验证采用Western blot与免疫组化互补策略。Western blot流程RIPA裂解、BCA定量、SDS-PAGE分离、转膜、封闭、一抗二抗孵育及化学发光检测，以目的条带与内参蛋白灰度比值表示相对表达；常测靶点TLR4、MyD88、p-NF-κB p65、E-cadherin、α-SMA及GABAARα等。免疫组化与免疫荧光在组织原位定位蛋白分布，阳性表达以染色强度结合阳性面积半定量评分。两法结果宜相互印证，抗体须经预实验验证特异性，避免非特异条带导致的误判。
流式细胞术检测Th17/Treg分型
肺组织、脾脏及引流淋巴结制备的单细胞悬液经刺激阻断后，以荧光标记抗体标记表面分子CD4，固定穿膜后标记胞内IL-17A与Foxp3，据此区分Th17与Treg细胞比例，并计算Th17/Treg比值反映免疫失衡方向。CD4阳性细胞内RORγt与Foxp3转录因子共染可辅助确认分型。样品制备须控制酶消化时间以保全表面抗原，全程低温操作并设置同型对照与荧光-minus-one对照。LncRNA MALAT1等分子与Th17/Treg平衡的相关性研究亦以该比值作为核心读出指标。
检测结果判定与送检须知
模型成立判定需多指标联合：气道反应性剂量反应曲线上移、灌洗液炎症细胞增多、病理评分升高、IL-17A等因子表达上调，各项结果相互印证方可确认重度表型。送检前应明确小鼠品系、致敏原种类、激发方案与取材时间点，并随附分组信息；肺组织需按检测项目分装，避免反复冻融；灌洗液与血清样品低温运输。涉及PCR与流式检测的项目应预留足量组织。结果解读时须结合阴性对照与阳性药物对照数据，区分建模效应与操作变异，据此评估药物干预或基因修饰的实际影响。
