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眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验检测

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发布时间：2025-07-15 22:54:13 更新时间：2025-07-14 22:54:14

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验检测

眼刺激性/腐蚀性检测是评估化学品、化妆品原料、药品及医疗器械等可能对眼睛造成损害的毒理学关键项目。传统的兔眼试验虽被广泛使用，但由于存在伦理争议和对动物福利的关注，开发和应用替代方法日益重要。鸡胚绒毛尿囊膜试验（HET-CAM, Hen's Egg Test on the Chorioallantoic Membrane）作为一种重要的体外替代方法，因其与兔眼试验具有良好相关性，且相对快速、成本较低，被广泛应用于初步筛选物质的眼刺激性/腐蚀性潜力。该试验利用发育中鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）模拟人眼结膜组织，通过观察受试物作用于CAM后引起的血管损伤（如出血、凝血、血管溶解等）效应来预测其对眼睛的潜在危害。

检测项目

鸡胚绒毛尿囊膜试验（HET-CAM）的核心检测项目是评估受试物对鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）的刺激性/腐蚀性效应。具体观察和评分的终点指标包括：

1. 出血 (Hemorrhage, H)： 血管破裂导致血液渗入膜组织或周围区域。
2. 凝血/血管内凝血 (Coagulation/Vascular thrombosis, C)： 血液在血管内凝固形成血栓，导致血管闭塞，表现为血管变白或出现凝块。
3. 血管溶解 (Lysis, L)： 血管壁或周围膜组织发生溶解、破坏，导致血管结构消失或膜变得透明。
4. 其他可见损伤： 如膜的颜色变化、透明度改变、水肿或严重的膜结构破坏等。

试验结果通常根据这些观察终点的出现时间、严重程度和持续状况进行评分，最终得出一个刺激性指数（Irritation Score, IS），据此对受试物的眼刺激性/腐蚀性潜力进行分级（如无刺激性、轻微刺激性、中度刺激性、严重刺激性/腐蚀性）。

检测仪器

进行HET-CAM试验主要需以下仪器和设备：

1. 恒温恒湿孵化箱： 用于控制温度和湿度（通常37.5°C ± 0.5°C，相对湿度 > 60%），孵化受精鸡卵至所需日龄（通常9-11天）。
2. 鸡蛋开窗工具： 包括钻孔器（或小型电钻）、镊子、剪刀等，用于在蛋壳上开孔暴露CAM。
3. 立体显微镜（带光源）： 用于清晰观察CAM上的血管网络结构和受试物作用后引起的细微变化（出血、凝血、溶解等）。配备冷光源或光纤照明避免热量影响。
4. 移液器及吸头： 用于精确吸取和施加受试物溶液、阳性对照液（如1% SDS水溶液）和阴性对照液（如生理盐水）。
5. 计时器： 精确记录观察终点出现的时间（从施加受试物开始计时）。
6. 废物处理容器： 用于安全处理废弃的鸡胚、蛋壳等生物废弃物。
7. (可选) 图像采集与分析系统： 数码相机连接显微镜，用于记录试验过程，并使用专业软件进行血管变化（如密度、长度）的定量分析，提高客观性和可追溯性。

检测方法

HET-CAM试验的标准操作流程（基于OECD 492等）主要包括以下步骤：

1. 鸡胚准备： 选择受精的特定品种（如白来航）鸡卵，在标准条件下（37.5°C， >60%RH，定期翻蛋）孵化9-11天。
2. 气室标记与开窗： 在孵化第9天（或试验当天），用照蛋灯确定气室位置并标记其边界。在气室端远离主要血管区域小心钻孔（或开一约1cm²窗口），移除蛋壳和壳膜，暴露其下的绒毛尿囊膜（CAM）。操作需轻柔，避免损伤血管。
3. 受试物施加： 将CAM暴露于空气中约30秒至1分钟（使膜干燥清晰）。用移液器将0.3 mL受试物溶液（或固体/粘稠物适量）直接、轻柔地滴加在CAM表面（避开大血管）。同时设置阳性和阴性对照。
4. 观察与评分： 立即开始计时，在立体显微镜下连续观察CAM至少5分钟（通常观察至30秒、2分钟、3分钟、5分钟等固定时间点），记录终点H（出血）、C（凝血）、L（溶解）首次出现的时间（秒）。评分标准通常为：
- 观察时间内未出现终点：评0分；
- 终点在30秒内出现：评5分；
- 终点在30-120秒出现：评3分；
- 终点在120-300秒出现：评1分。
5. 计算刺激性指数 (IS)： IS = [(301 - H_t) / 300 * 5] + [(301 - C_t) / 300 * 7] + [(301 - L_t) / 300 * 9]。其中H_t, C_t, L_t分别为该终点首次出现的时间（秒），若未出现则记301秒。公式中权重因子（5,7,9）反映不同终点对刺激性的相对贡献（血管溶解>凝血>出血）。
6. 结果判定： 根据计算的平均IS值（通常重复3次有效试验取均值）对受试物分类（示例分类，具体阈值参照标准）：
- IS < 1: 无刺激性
- 1 ≤ IS < 5: 轻微刺激性
- 5 ≤ IS < 9: 中度刺激性
- IS ≥ 9: 严重刺激性/腐蚀性
7. 鸡胚处置： 试验结束后，立即人道处死鸡胚（如深度冷冻）。

检测标准

HET-CAM试验作为重要的眼刺激替代方法，已有国际认可的标准操作规范：

1. OECD 492： 《体外皮肤腐蚀：经皮电阻试验和人类皮肤模型试验，以及眼刺激：鸡胚绒毛尿囊膜试验方法》。这是目前最权威的国际标准，详细规定了HET-CAM试验用于鉴别严重眼刺激物/腐蚀物的具体程序、接受标准、数据解释和报告要求。(最新版：OECD Guideline No. 492, adopted 22 July 2015, corrected 21 January 2021).
2. ISO 10993-10： 《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与皮肤致敏试验》。该标准在评价医疗器械的眼刺激潜力时，也认可HET-CAM作为筛选或替代试验方法之一。
3. EU B.47： 欧盟REACH法规下的一项测试方法（鸡胚绒毛尿囊膜试验），用于评估物质的眼腐蚀性/严重眼刺激性。
4. 各国/地区药典或行业指南： 一些国家的药典或化妆品、化学品管理机构发布的指南也可能参考或推荐使用HET-CAM试验进行眼刺激性的初步评估。

注意： HET-CAM主要用于鉴别严重眼刺激物/腐蚀物（GHS类别1），或用于无/轻微刺激性物质的初步筛选。对于区分轻中度刺激物（GHS类别2A/2B），其能力有限，通常需要结合其他体外测试方法（如重建人角膜上皮模型试验，如OECD 492中另一部分或OECD 437）或进行综合评估策略（IATA）。严格遵守标准操作规程（SOP）和良好实验室规范（GLP）要求对于确保结果的重现性、可靠性和可接受性至关重要。