APCMin/+小鼠自发性结直肠癌癌前病变模型

1、APC^min基因信息

APC（adenomatosis polyposis coli）基因编码的蛋白是一种肿瘤抑制蛋白，充当Wnt信号传导途径的拮抗剂。APC-β-catenin-TCF主导的Wnt通路失调是家族腺瘤息肉病发生的主要途径。APC蛋白表达的缺失或降低可能导致β-catenin免于降解，使游离的β-catenin在胞浆内集聚并进入核内，激活相关靶癌基因，导致细胞癌变的发生。APC蛋白还涉及其他生物调节过程，包括细胞迁移和粘附，转录激活和细胞凋亡。APC-Min（Min: multiple intestinal neoplasia）突变小鼠特指APC基因第850位氨基酸出现突变的C57BL/6J小鼠。APC基因第850位氨基酸从Leu突变成终止密码子，导致翻译提前终止。APC-Min小鼠品系采用基因编辑技术制作，该品系纯合子不能存活。高脂饮食条件下，雄性和雌性杂合小鼠有明显的肠道腺瘤且数量较多，多见于回肠和空肠。因此，APC-Min小鼠模型是理想的肠道肿瘤模型。
2、实验动物背景信息

APC^Min/+小鼠发病机制是突变的基因产物,截短APC蛋白导致肠道上皮细胞胞质β-catenin蛋白的积累而后使其入核与TCF4/LEF转录因子结合启动下游基因CyclinD 1等原癌基因的活化，但是其腺瘤发生、发展规律和其他生物学特性尚未探索清楚。

3、研究背景

结直肠癌是世界上第三大恶性肿瘤[1]。从肿瘤学角度研究，结结肠癌的诱发与DNA的错配修复密切相关，并涉及到多个癌症相关基因的复杂变化过程[2-4]。1991年研究人员发现，结肠腺瘤性息肉基因（adenomatous polyposis coil,APC）是诱发家族性腺瘤息肉病（famolial adenomatous polyposis，FAP）的主要原因，且APC基因突变是诱发结直肠癌发生的早期事件[5]。FAP的主要特征是：结直肠中发育异常的病灶逐渐增长，并发展成为数百或数千个腺瘤性息肉或腺癌。APC主要在细胞核、浆中发挥重要的作用，并在机体多个组织器官和肿瘤细胞系中表达，如肝脏、肠和肠癌细胞系等[6-7]。结直肠肿瘤的发生发展是多基因，多步骤参与的过程，与生活方式、饮食结构、遗传因素和多基因突变都密切相关。由于在人体研究存在诸多限制，因此需要一种客观性、重复性、公认性均较好的动物模型进行深入研究。

[1] FERLAY J, SHIN H R, BRAY F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 [J]. International journal of cancer, 2010, 127(12): 2893-2917.

[2] DE LA  CHAPELLE  A. Genetic predisposition to colorectal cancer [J]. Nature reviews cancer, 2004, 4(10): 769-780.

[3] MECKLIN J P. Frequency of hereditary colorectal carcinoma [J]. Gastroenterology, 1987, 93(5): 1021-1025.

[4] PONZ  DE  LEON  M,  SASSATELLI  R,  SACCHETTI  C,  et  al.  Familial aggregation  of  tumors  in  the  three-year  experience  of  a  population-based

colorectal cancer registry [J]. Cancer research, 1989, 49(15): 4344-4348. 

[5] KINZLER  K  W,  NILBERT  M  C,  SU  L  K,  et  al.  Identification  of  FAP  locus genes from chromosome 5q21 [J]. Science, 1991, 253(5020): 661-665.

[6] Su  LK,  Kinzler  KW,  Vogelstein  B,  Preisinger  AC,  Moser AR,  Luongo  C, Gould  KA,  Dove  WF.  Multiple  intestinal neoplasia  caused  by  a  mutation  in  the murine  homolog  of  the APC gene. Science, 1992, 256(5057): 668−670.

[7] Silverman  KA,  Koratkar  R,  Siracusa  LD,  Buchberg  AM. Identification  of  the  modifier  of  Min  2  (Mom2)  locus,  a  new  mutation  that  influences Apc-induced  intestinal  neo-plasia. Genome Res, 2002, 12(1): 88−97.

APC^Min/+小鼠，C57BL/6J小鼠，体重秤，清洁级动物房，手术剪，耳标，IVC笼盒，Co60照射的高脂饲料，PBND，蛋白酶K, promega GO TAQ Green Master Mix, takara 100bp DNA ladder, TBE缓冲液，亚甲蓝，小鼠抗人β-catenin单克隆抗体(BD Trans-ductionLaboratorie,Cat,610154),小鼠抗人cyclinD 1(SantaCruz,Cat,sc-8396);二抗为过氧化辣根酶标记山羊抗小鼠IgG, DAB显色液，苏木精染液，显微镜，凝胶成像仪，甘油三酯试剂盒及总胆固醇试剂盒等。

实验操作规程： APCMin/+雄性成年小鼠和C57雌性成年小鼠以1∶2的比例杂交，三个月后，其F1代中既有APCMin/+小鼠（腺瘤表型），又有C 57小鼠，进行全同胞兄妹交配，扩大种群。使用PCR方法对新生小鼠进行剪尾提取基因签定。小鼠在正常饲养时或者高脂饲料饲养时均会出现肠道肿瘤，但是肿瘤数量，体积随着饲养年龄增长而具有明显差异。 

该模型使用HE方法对APC min小鼠的小肠大肠部位进行病理评估，确认小鼠在小肠和大肠部位可以形成腺瘤，比较不同周龄小鼠的腺瘤数目和大小，发现腺瘤的发生发展规律。通过免疫组织化学染色方法确定β-catenin的表达量变化，进而助于阐明其发病机制。通过检测24周龄小鼠的红细胞数及血红蛋白、总胆固醇及甘油三酯含量，发现随着腺瘤数目和体积的增大对小鼠的影响。