H7N9禽流感病毒感染小鼠模型

BALB/c为近交系小鼠，遗传背景一致，微生物背景可控，个体间相似度高，易于操作；小鼠相关的免疫球蛋白、细胞类型、细胞因子等试剂己商品化，费用和饲养要求低。此外，H7N9病毒直接感染的BALB/c小鼠，感染模型主要表现为下呼吸道感染，重症肺炎，肺部病理学损伤类似人感染后的严重病例，甚至导致小鼠死亡。所以BALB/c小鼠可作为研究流感病毒致病性、传播力及传播机制的主要动物模型之一。

1. 实验环境

生物安全实验室3级：参照2013年4月2日卫计委专家对新发甲型H7N9禽流感病毒生物安全评估会议指南暂定H7N9禽流感病毒属于二类。将H7N9禽流感生物危害等级定位Ⅲ级。已被我国列为按甲类传染病管理的乙类传染病，对其病原体和动物感染实验的操作应该在ABSL-3实验室中进行。

独立通风笼（IVC）

2. 实验材料

1）毒株：H7N9毒株（A/Anhui/1/2013）；

2）实验动物：SPF 雌性4-6周龄BALB/c小鼠；

3）试剂：DMED培养液，RNeasy Mini Kit（QIAGEN，74106）等

4）实验仪器：

微型离心机（EASTWIN6000）

高速冷冻离心机(KUBOTA3500)

电动研磨器(德国IKA-T10)

倒置显微镜(Nikon)

实时荧光定量检测系统（ABI）

二氧化碳培养箱（Thermo371）

生物安全柜

3. 实验操作规程
1）动物分组：H7N9流感病毒感染20只4-6周龄BALB/c雌性小鼠，其中10只为临床观察组，另外10只用于检测病毒的组织分布，为解剖组（5只于感染后3天安乐并解剖，5只于感染后5天安乐并解剖）。
2）病毒接种：动物适应后使用三溴乙醇以0.02mL/g比例进行肌肉注射麻醉。麻醉后每只小鼠滴鼻接种0.05mL病毒效价为10⁵TCID50/mL的病毒稀释液。
3）临床指标：对临床观察组（n=10）小鼠进行持续21天的观察，感染后0-14天每天记录体重和死亡率，观察动物的一般状况，包括眼、鼻、口、脸、耳、爪、四肢、肛门、尾、被毛、活动和精神状况，体重下降率超过25%为人道终点实行安乐。
4）病毒的组织分布：解剖组小鼠（n=10）感染后3天和5天各解剖5只（n=5），取脑、气管、肺、肾、眼拭子进行病毒滴度测定。
5）病毒分离：感染后第3、5天感染雪貂安乐处死，尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织，研磨处理后，接种MDCK细胞。每天观察病变，持续观察3d，用火鸡红细胞测定HA确认。HA方法具体为：将接种标本的MDCK上清液取出50uL，加入等体积火鸡红细胞，室温反应30min，出现凝集反应，结果为阳性。
6）H7N9病毒RNA的检测：感染后第3、5天感染雪貂安乐处死，尸检时取肺、气管、肝、脾、脑、肠、心和肾组织，研磨处理后，操作步骤：将100uL组织研磨液上清移入裂解液（Qiagen）中，放入buffer RLT（已加入1%巯基乙醇）350uL，4℃，13000rpm离心3min，将上清转移至新1.5mL微量离心管中，提取组织研磨液核酸。使用RNA一步法试剂盒，通过荧光定量PCR仪直接测定病毒载量。
7）H7N9病毒抗体检测：动物感染后不同时间点采血分离血清，-80℃下保存备用。血清H7N9病毒性抗体检测（HI方法）具体操作步骤为：每孔加入1:10~1:1280稀释的待检血清，加入8HA的病毒，室温孵育30min。此后检测凝集结果，血清凝集的效价为该血清可中和的抗体的效价。
8）病理学研究：大体观察，处死动物后，详细观察肺、心、脾、肾、肝、脑、肠以及淋巴结等组织的形态变化；病理切片准备，取处死动物的肺等组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE或免疫组织化学染色后，镜检观察。