Zika病毒感染小鼠模型

BALB/c小鼠(BALB/c Mouse)

BALB/c为近交系小鼠，遗传背景一致，微生物背景可控，个体间相似度高，易于操作；小鼠相关的免疫球蛋白、细胞类型、细胞因子等试剂己商品化，费用和饲养要求低。

1. 实验环境

生物安全实验室3级：参照2013年4月2日卫计委专家对新发Zika病毒生物安全评估会议指南暂定Zika病毒属于三类。将Zika动物实验在生物安全三级实验室内进行。已被我国列为按甲类传染病管理的乙类传染病，对其病原体和动物感染实验的操作应该在ABSL-3实验室中进行。

2. 实验材料

1）毒株：Zika毒株（ZKC2/2016）；

2）实验动物：SPF 8周龄雌性及雄性 BALB/c小鼠；

3）试剂：DMED培养液，RNeasy Mini Kit（QIAGEN，74106）等

4）实验仪器：

微型离心机（EASTWIN6000）

高速冷冻离心机(KUBOTA3500)

电动研磨器(德国IKA-T10)

倒置显微镜(Nikon)

实时荧光定量检测系统（ABI）

二氧化碳培养箱（Thermo371）

生物安全柜

3. 实验操作规程

3.1 动物的饲养与繁育

1）伦理申请：按照实验动物伦理要求向北京协和医学院医学实验动物研究所动物使用和伦理委员会提交实验动物使用申请表。并获得批准（批准号：ILAS-BLL17007）。

2）小鼠饲养：8周龄SPF级雌性及雄性BALB/c小鼠均饲养于SPF级独立通风屏障系统中，饲养房间温度24-26℃，每天光照约14h。动物自由饮水取食。大约每周换3次垫料。

3）BALB/c小鼠的繁育：每笼放8周龄SPF级雌性及雄性各一只，每日上午观察雌鼠的阴道栓塞。见阴道栓塞后将雄性小鼠方另一单笼饲养备用。分笼后需给母鼠添加生长繁殖饲料，大约18日后每日上午10点左右观察怀孕母鼠的生育情况。规定每天观察的生育的小鼠为0.5天；如有其他情况在10点以后观察到小鼠妊娠或妊娠完成，记作第2天生育乳鼠。初生24-36h的乳鼠用于Zika病毒攻毒。

3.2 ZKC2/2016病毒的传代

1）防护：涉及Zika病毒活病毒的所有动物实验，将动物置于具有HEPA过滤器的负压分离器中，按照Zika病毒应急生物安全手册的要求在生物安全水平3（BSL-3）的动物设施中进行，并应根据病原微生物的危害等级穿戴相应的防护用品。

2）病毒接种：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制出血热室馈赠的ZKC2/2016，提前解冻至室温，利用美国BD公司1ml胰岛素注射器（针头较细对动物的损伤较小）吸取25ul病毒液，注射上述24-36h的乳鼠脑中缝处。注意插针、注射及取针动作要轻柔以免对动物造成过大的损失。整个过程尽量让专人操作，操作人员受过专业培训并考核合格，保证每只乳鼠注射的位置、进针深度大致相同。

3）动物观察：攻毒后轻轻地将乳鼠放回原处，攻毒后乳鼠可能会出现尿失禁的现象。攻毒后的乳鼠体温会下降，注意保温。第2天观察乳鼠若出现死亡情况将乳鼠捡出，可能是死于机械损伤，冻存于-80℃冰箱以备统一高压灭菌或直接高压灭菌。

4）动物解剖：每天观察乳鼠情况，并于攻毒后第5天经处死乳鼠。利用解剖剪刀和镊子将鼠脑取出，放到提前在冰上提前预冷的2ml EP管中。

5）组织处理：将取出的感染Zika 病毒的鼠脑带至生物安全2级实验室进行下一步操作。传第一代病毒命名为ZKC2P1,第二代为ZKC2P2，以此类推。

3.3 适应株病毒鉴定

利用本研究设计的引物Zika 535和Zika 1211C，扩增Zika 病毒核酸获得包括引物探针的区域（835-911），PCR产物纯化后连接pGEM-T Easy载体，利用pGEM-T上的T7启动子，使目的片段535-1211可以在体外转录。

3.4 ZKC2P6对乳鼠致病力

选取24-36h乳鼠9窝，调整每窝乳鼠数量为6只，随机分为三组。ZKC2P6组、ZKC2P4及模拟感染组 (Mock) 分别脑内注射25ul含1.5×10⁷ copies ZKCP6病毒液、25ul含1.5×10⁷ copies ZKCP4病毒液及年龄匹配的空白鼠脑研磨上清液。攻毒后1dpi、3dpi、5dpi及7dpi称量每只乳鼠的体重并记录死亡情况。每组随机选取另外3窝乳鼠，攻毒后1dpi、3dpi、5dpi及7dpi每天取三只乳鼠脑并称量重量、测量长、宽。本研究利用Zika病毒感染初生乳鼠后观察小鼠大脑皮层及脑室的变化。将上述称量脑重的鼠脑固定后进行HE染色。ZKC2P4与ZKC2P6分别脑内感染一窝乳鼠（每窝6只），第3天和第5天分别取3只鼠脑并称重，按照病毒RNA提取操作流程提取RNA。