Isca1心肌特异性基因敲除SD大鼠模型_【CMA/CNAS认证】

资源中文名称

Isca1心肌特异性基因敲除SD大鼠

资源英文名称

Isca1(tm-loxP)/α-MHC-Cre

疾病概述

心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏收缩和（或）舒张功能障碍，无法将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统灌注不足，从而引发心脏循环障碍症候群，心衰并不是一个独立的疾病，而是所有心血管疾病发展的终末阶段。近年来，随着我国社会老龄化和高血压，冠心病等心血管疾病发病率的增加，使得心衰呈现高发病率，高致残率和高死亡率的特点，《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%，有1000万左右的心衰患者。几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生，而在基础性心脏病的基础上，一些因素亦可诱发心衰的发生，常见诱因包括，感染，严重心律失常，心脏负荷增大，药物中毒（如洋地黄）等等。心衰在临床上可分为急性心衰和慢性心衰。临床表现，包括呼吸困难，运动耐力下降，心室腔增大，心脏功能下降（LVEF<40-50%），心脏顺应性降低，心室腔内淤血，肺循环及体循环淤血。临床检查手段，包括超声影像分析，心电图，心衰标志物（B型利钠肽（BNP），N末端B型利钠肽原（NT-proBNP））心肌坏死标志物（心肌肌钙蛋白T（cTnT）及心肌肌钙蛋白I（cTnI））。临床治疗方法，包括强心（米力农，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重构（卡维地洛）及心脏移植。

实验动物背景信息

SD大鼠

模型制作方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

仪器及耗材	生产厂商
NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪	日本滨松光子学株式会社
Vevo770小动物超声影像系统	VisualSonics
激光共聚焦扫描显微镜	Leica
透射电子显微镜	JEOL
显微注射仪	Nikon
光学显微镜	Nikon
化学发光凝胶成像系统	BIO-RAD
PCR仪	BIO-RAD
组织脱水机	Leica
石蜡切片机	Leica
石蜡包埋机	Leica
冰冻切片机	Leica
电泳仪	BIO-RAD
电泳槽	Tanon
数码凝胶图像处理系统	Tanon
组织匀浆机	POLYTRON
恒温培养箱温控振荡箱	Incucell TAITEC
离心机	Eppendorf
摇床	SCILOGEX
塑料薄膜封口机	德清拜杰有限公司
电动鼓风干燥箱	天津市泰斯特仪器有限公司
电子称量器（量程0.5g-620g）	奥豪斯仪器（常州）有限公司
电子称量器（量程0.1mg-220g）	Sartorius
4℃冰箱	海尔集团
-80℃冰箱	SANYO
-20℃冰箱	SANYO
涡旋振荡器	上海沪西分析仪器厂
移液器	Eppendorf

3.1.3实验试剂

试剂	生产厂商
体外转录用试剂盒	Ambion
Taq DNA聚合酶	TaKaRa
T7 转录试剂盒	Invitrogen
T4 DNA裂连接	TaKaRa
胶回收试剂盒	Qiagen
质粒提取试剂盒	Axygen
Trizol试剂	Invitrogen
逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒	Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司
ISCA1（PA5-60121）抗体	Invitrogen
GADPH	Santa Cruz Biotechnology
NC膜	Millipore
化学发光液	Immuno Cruz
蛋白质分子量标记物	Takara
蛋白酶抑制剂	罗氏
组织裂解液	Thermo
丽春红	Beyotime
BCA试剂盒	Beyotime
Western blot 洗液（10×）	Beyotime
30%Acr-Bis	Beyotime
SDS-PAGE电泳液	Beyotime
Western blot转膜液（粉剂）	Beyotime
TEMED	Beyotime
过硫酸铵	Beyotime
1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液	Beyotime
1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液	Beyotime
琼脂	BD公司
异丙醇	北京化工厂
脱脂奶粉	内蒙古伊利实业集团股份有限公司

3.1.4模型构建流程

利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1^flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。

3.1.5 Isca1条件性敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立

3.1.5.1 Isca1条件性敲除大鼠模型的建立

设计方案

图 1. Isca1条件性敲除模型构建设计方案

构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG

R-ISCA1-gRNA UP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT

R-ISCA1-gRNA DOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC

靶点2:

AGCCCTGAACTCCTTATG TGG

R-ISCA1-gRNA UP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG

R-ISCA1-gRNA DOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。
构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
显微注射

超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。
受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

基因型鉴定

剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
根据测序结果确定Isca1条件性敲除模型大鼠（SD. Isca1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠（Isca1^flox/flox/MHC-Cre）的建立

根据3.1.5.1获得Isca1^flox/+大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Isca1^flox/+与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Isca1^flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1^flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠（SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右Isca1^flox/+大鼠与Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交，可得到Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠，用于后续实验。