重症登革热小鼠模型

小鼠模型是登革病毒感染及登革热发病机制研究的重要工具。科研人员最初使用登革病毒临床分离株颅内感染正常小鼠，感染效果差，且出现麻痹等神经症状，不适合建立动物模型。之后，鉴于干扰素的抗登革病毒作用，研究者利用缺乏IFN-ɑ/β、IFN-γ受体的AG129小鼠构建登革病毒感染模型，但存在一定程度的免疫抑制，限制了该模型的应用。然后，为建立免疫完整性更高的小鼠模型，使用交替传代病毒株感染I型干扰素受体敲除小鼠（Ifnar1^-/-）建立小鼠模型。这些模型都未能很好的展现血浆渗透、血小板降低、肝肾损害等重症登革热的典型表现。基于此，本研究拟通过小鼠体内传代，获得登革病毒小鼠适应株，感染Ifnar1^-/-小鼠建立重症登革热小鼠模型。

1. 小鼠感染：使用1ml胰岛素注射器分别吸取100 μL病毒液（8×10⁶ Copies/μL），尾静脉接种4-6周Ifnar1^-/-小鼠。每日进行称重，观察小鼠临床表现。发病率评分基于Orozco等人描述的1至5的等级：1. 健康；2. 轻度嗜睡；3. 嗜睡、竖毛、弓背；4. 嗜睡、竖毛、弓背、虚弱；5. 垂死。感染后第2、4、6、8天动物眼眶采血，用于血常规检查；分离并冻存血清，用于病毒载量测定；血浆用于细胞因子测定；分批安乐小鼠，采取肠、脾脏、肾脏、肝脏、脑等器官，用于病毒载量检测及组织病理学观察。

2. 病毒载量检测：使用实时荧光定量PCR方法检测小鼠血清和组织中的病毒核酸。简单的，配置反应体系，上下游引物及探针序列分别为DENV-F: 5’-GAR AGA CCA GAG ATC CTG CTG TCT-3’，DENV-R: 5’-ACC ATT CCA TTT TCT GGC GTT-3’, Probe: (FAM)AGC ATC ATT CCA GGC AC (MGB)。Real-time PCR反应条件为：50℃ 30min；95℃ 15min；94℃ 15s；60℃ 60s，40个循环。

3. 全血细胞计数：收集300μL小鼠血液至EDTA抗凝管中，使用爱德士ProCyte Dx* 全自动血细胞分析仪对样本进行血细胞分析。方法如下：首先输入样本编号，选择小鼠物种、类别和模式；其次准备样本：轻轻倒转样本10次，确保其混合均匀；最后将装有样本的采血管放入适配器；然后开始分析。主要分析：红细胞计数（RBC）、红细胞比容（HCT）、血小板计数（PLT）、中性粒细胞计数（NEUT）、淋巴细胞计数（LYMPH）。

4. 组织病理学观察：安乐小鼠，解剖采集肠、脾脏、肝脏、肾脏、脑组织，进行苏木精-伊红（HE染色）。方法简述：组织块经10%的多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片；切片脱蜡后进行HE染色；进一步的脱水透明，封片，显微镜下观察。

5. 细胞因子分析：收集300μL小鼠血液至EDTA抗凝管中，分离血浆，进行细胞因子检测。方法简述：1）稀释试剂 ；2）溶解标准品并对倍稀释；3）准备微球，与样本共同孵育；4）洗板；5）加入检测抗体；6）再次洗板；7）加入SA-PE ；8）洗板； 9）上机检测 ；10）结果分析。