结核树鼩模型

菌株准备

　　结核分枝杆菌标准株H37Rv或耐药株（内部编号94789）经小鼠体内两次增毒，于罗氏斜面培养基培养，收获斜面培养3周的细菌经5μm无菌滤器( Millipore公司)制成单细胞菌悬液，经罗氏斜面培养基培养计数，单细胞悬液菌浓度为1× 10⁷ CFU /ml，单细胞悬液分装冻存于－80℃低温冰箱备用。

动物的选择

　　中缅树鼩，1年龄，雄性，清洁级，体重100-170g，购自中国科学院昆明动物研究所。实验动物的使用得到了北京协和医学院中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管理委员会的批准（批准号ILAC-PC-2012-003），动物在感染前一周进入医学实验动物研究所生物安全3级实验室。

动物分组与感染

　　取树鼩固定于保定袋中，暴露股静脉，75%酒精擦拭消毒，静脉注射250μl结核分枝杆菌H37Rv单细胞悬液，感染剂量为2.5× 10⁶ CFU（高剂量组），将H37Rv单细胞悬液稀释1000倍，再静脉注射250μl，感染剂量为2.5× 10³ CFU（低剂量组），高低剂量组各感染树鼩10只，4只为正常对照组，股静脉注射同等体积的生理盐水，所有实验均在医学实验动物研究所生物安全3级实验室（BSL-3）进行操作。

样本采集

　　攻毒后每天观察树鼩活跃度，用红外线体温计监测树鼩体温，每周称量一次体重。

　　感染后5W高剂量组取4只（其中一只病重死亡，死亡后及时解剖），低剂量组取4只，正常对照组取4只，8W高、低剂量组各取3只，11W高剂量组取3只，低剂量组取3只腹腔注射2%戊巴比妥钠（剂量为40mg/Kg）麻醉后心脏采血处死；1.6ml血液放置血沉管中，轻柔颠倒混匀数次，垂直静置血沉架上30分钟后读取1小时血沉值，约1.5ml血液放置血常规管，轻柔颠倒混匀数次，用动物血细胞分析仪检测血常规； 无菌取各组织，先后经过生理盐水、4%硫酸和生理盐水漂洗，进行组织病理分析、荷菌量检测、蛋白质谱分析和部分差异蛋白转录水平的分析。

组织病理分析

　　将采集后的各组织用4%中性甲醛固定一周后，常规方法切片、HE染色，光学显微镜观察病理组织学变化。

组织荷菌量检测

　　无菌取各组织约50mg，漂洗后加1ml生理盐水用玻璃组织研磨器研磨，组织悬液经无菌生理盐水按照1：10稀释后取0.1ml接种罗氏斜面培养基，平行接种3管。以上2个浓度均置于37℃，5%CO2培养箱中培养4周后进行菌落计数。

组织切片抗酸染色

　　病理组织片按常规方法脱蜡后染色，将脱蜡后的组织切片置于湿盒内，滴上抗酸初染液，90℃水浴5分钟后用细流水倾斜冲洗玻片至初染液洗掉后再滴上复染液脱色复染，直至玻片上的组织呈淡蓝色；镜检。

蛋白质谱分析

　　将高剂量组、低剂量组、正常对照组三组肺组织样品于沸水中5分钟灭活结核分枝杆菌。送公司进行蛋白样品的裂解、浓度测定， 蛋白酶解后用iTRAQ标记各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。基于Triple TOF 5600进行LC-ESI-MS/MS质谱分析。基于NCBI树鼩核酸序列数据库（50461 sequences），利用蛋白质鉴定软件Mascot 2.3.02进行检索，选择已经建好的数据库，进行数据库的搜索，并对质谱质量进行评估。获得的数据进行蛋白质生物信息学分析，包括差异蛋白的筛选，进行GO、COG注释，差异蛋白Gene Ontology富集分析、pathway富集分析，以及多样品间表达模式聚类分析。随机选取部分差异蛋白，用SYBR-Green的荧光定量PCR进行转录水平的分子验证。即从ITRAQ筛选的差异表达基因中选择一部分与结核感染相关的基因进行qRT-PCR验证。