人大细胞肺癌H460红色荧光标记肿瘤模型

　　H460细胞系于1982年由A.F. Gazdar自一个男性大细胞肺癌患者的胸腔积液中培养获得。与普通肺癌细胞相比，该细胞具有较高水平的p53 mRNA的表达并且无总DNA结构异常。免疫酶标染色显示，该细胞具有角蛋白和波形蛋白阳性反应，但神经丝三联体蛋白反应阴性。该细胞是人亚三倍体细胞系，典型的染色体数是57,或者58条染色体数细胞也存在一定的比例，X和Y染色体在所有细胞中都存在2个拷贝数。

　　无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

　　本实验中所用鼠种BALB/C-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/C-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/C-nu/+）。采用BALB/C-nu/+♀与BALB/C-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，窝平均仔鼠成活3.62只，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

　　模型制作采用BALB／CA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

4.1细胞培养：H460细胞为本实验室冻存

4.2构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-DsRed

图1红色荧光表达载体的构建

4.3细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent转染H460细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达RFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

图2红色荧光标记的H460细胞系（200×）

　　稳定高表达RFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆RFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达RFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4.4肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。