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彗星实验

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发布时间：2024-05-21 08:15:32 更新时间：2025-02-18 14:33:12

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　　彗星实验去哪里做?中析研究所检测中心可做各类彗星实验，出具第三方检测报告。

一、彗星实验介绍

　　“彗星”实验又称单细胞凝胶电泳实验，是一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单、双链缺口损伤的程度。当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。在电泳过程中，这些DNA断链及片段带会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。同时，这种技术只需要少量细胞。

二、客户提供标本或者相关资料

　　1. 研究用细胞或组织;

　　2. 检测的指标;

　　3. 请客户提供DNA受损详细相关信息或相关文献。

三、单细胞凝胶电泳实验流程

　　1.细胞接种：单细胞凝胶电泳实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行单细胞凝胶电泳实验当天细胞密度应达到60%～80%覆盖;

　　2. DNA损伤处理;

　　3. 收集细胞，制备单细胞悬液;

　　4. 制备胶板;

　　5. 细胞裂解与电泳;

　　6. 中和与染色;

　　6. 荧光显微镜拍照，记录实验结果。

四、最终结果

　　1. 阴性对照结果;

　　2. 具体试验流程(包括：实验步骤;主要仪器及试剂说明(含仪器厂家、型号;试剂厂家、批号));

　　3. 原始实验图片及数据。

　　1.制片

　　第一层胶: 将预热45℃的80ul, 0.6% 的正常熔点琼脂糖(NMA ) 滴在磨砂载玻片的磨砂面上, 迅速用一干净玻片边缘将胶铺平, 或加盖盖玻片压平胶面, 将玻片臵保湿盒内,4℃,10 min 使胶凝固。第二层胶: 将10ul待测细胞悬液盒75ul, 0.6% 的低熔点琼脂糖(LMA ) 在

　　37℃混匀,滴在第一层胶板上(加盖玻片者需先轻轻揭去盖玻片) , 迅速加干净的盖玻片使胶铺平, 将玻片臵保湿盒内, 4℃,10 min使胶凝固。第三层胶: 在凝固的LMA层上滴加37℃,0.6%LMA,盖上盖玻片,使其凝固。铺第一层胶的目的是使第二层胶平整、附着紧密, 铺第

　　三层胶的目的是对第二层胶中的细胞起保护作用。

　　2.裂解

　　移去盖玻片, 将载玻片水平浸入新配臵的预冷4℃裂解液

　　( 2.5 mol/L NaCl, 100mmol/L Na2EDTA,10 mmol/L Tris, 1%肌氨酸钠, pH = 10, 用前加入1% 体积的Triton X2100, 10%二甲亚砜) 中至少1小时。此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜, 除去蛋白质、RNA 等, 仅存留核骨架。

　　3.解旋

　　从裂解液中取出载玻片, 用蒸馏水浸泡或PBS冲洗, 洗去胶表面的盐溶液然后将载玻片臵于水平电泳槽中,倒入新配制的碱性电泳缓冲液(1 mmol/L Na2EDTA,300 mmol/L NaOH, pH = 13), 约没过胶面0.25cm 左右, 碱解旋20～40 min, 以便使DNA 在碱性条件下解旋成单链DNA,使DNA 断片在电泳场中易于迁移。

　　4.电泳

　　电压25V,电流300mA,低温避光,电泳20～40min。

　　5.中和

　　将载玻片取出,用0.4 mmol/L Tris 缓冲液(pH = 7.5) 中和2～3 次, 每次5～15 min, 以除去碱和去污剂,以免影响染色效果。

　　6.染色观察

　　根据显微镜的滤镜种类选择染色剂。常用吖啶橙(2mg/L)、溴化乙啶 (20mg/L)、碘化丙啶(2.5～5.0 mg/L )、4,6-联脒-2-苯基吲哚(5 mg/L)或苯并嗯唑啉2-2喹啉等, 用量50～100ul, 滴臵胶板上, 盖上盖玻片, 24小时内检测, 时间过长将导致荧光减弱。上述过程均应在黄光或红光下操作, 以避免DNA 的额外损伤。

　　铺胶方法：

　　铺第一层胶时，玻片先放到水浴箱盖上(我用的是90度以上的)或其他地方预热，这样铺胶时胶不容易凝固，跟做血涂片时的推片类似，先让胶在盖玻片一侧边缘展开，然后放下盖玻片即可。冰盒中放置几分钟后，推掉盖玻片，将玻片放在水浴箱盖上烘干，冷至室温后再铺第二层，感觉不易脱胶，并且很容易铺开，方法同第一层。

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