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实时荧光PCR检测

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发布时间：2025-05-18 06:20:14 更新时间：2025-05-17 06:20:14

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

实时荧光PCR检测技术概述

实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescence Quantitative PCR）是近年来分子诊断领域的核心检测技术之一，通过将荧光信号与PCR扩增过程相结合，实现了对目标核酸的定量分析和实时监测。相较于传统PCR技术，其具有灵敏度高（可达拷贝级）、特异性强、自动化程度高等显著优势，广泛应用于病原微生物检测、基因表达分析、肿瘤标志物筛查及转基因成分鉴定等领域。该技术通过荧光染料或探针标记，在扩增过程中同步采集荧光信号变化，结合标准曲线或阈值循环数（Ct值）完成定量分析，为临床诊断和科研实验提供了精准可靠的数据支持。

主要检测项目

实时荧光PCR检测可覆盖多个关键领域：
1. 病原体检测：包括新冠病毒、流感病毒、HPV、结核杆菌等传染性病原体的快速筛查
2. 基因表达分析：用于肿瘤相关基因、药物代谢基因的mRNA表达水平定量
3. 转基因成分鉴定：食品及农作物中转基因元件的特异性检测
4. 遗传病诊断：囊性纤维化、地中海贫血等单基因遗传病的突变位点分析

核心检测仪器

主流的实时荧光PCR仪器需具备精确控温、多通道荧光检测和数据分析功能：
- ABI 7500系列：支持5色荧光通道，适用于多重检测
- Roche LightCycler® 480：采用离心式设计，升温速率达4.8℃/秒
- Bio-Rad CFX96：配备96孔模块，适合高通量检测
仪器需定期进行光学校准和性能验证，确保荧光信号采集的准确性。

标准化检测方法

检测流程严格遵循以下步骤：
1. 样本处理：采用磁珠法或柱式法提取核酸，并通过NanoDrop测定浓度
2. 引物/探针设计：使用Primer Express等软件设计特异性引物，TaqMan探针需标记FAM等荧光基团
3. 反应体系配置：包含Taq酶、dNTPs、buffer及内参基因（如β-actin）
4. 扩增程序设置：通常采用两步法（95℃预变性，95℃/60℃循环）或三步法（增加72℃延伸）
5. 数据分析：通过阈值线确定Ct值，采用△△Ct法进行相对定量

关键检测标准

检测过程需符合以下标准体系：
- ISO 20395:2019：生物技术核酸定量方法验证要求
- GB/T 27403-2008：实验室质量控制规范分子生物学检测
- CLSI EP17-A2：临床实验室定量检测方法的检出限评估指南
实验需设置阴性对照、阳性对照和空白对照，扩增效率应控制在90-110%之间，标准曲线相关系数R²≥0.99。