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最小抑菌浓度测定试验(营养肉汤稀释法)检测

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发布时间：2025-06-03 18:04:17 更新时间：2025-06-02 18:04:18

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

最小抑菌浓度(MIC)测定试验(营养肉汤稀释法)详解

最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）是衡量抗菌药物体外活性最核心的指标之一。它定义为在特定试验条件下，能够完全抑制某种微生物（细菌或真菌）肉眼可见生长的抗菌药物的最低浓度。MIC值的测定对于临床合理选择抗菌药物、判断细菌耐药性、制定个体化给药方案以及新药研发具有极其重要的指导意义。营养肉汤稀释法是测定MIC最经典、应用最广泛的方法之一，其原理是将抗菌药物在液体培养基（如Mueller-Hinton肉汤，MHB）中进行一系列倍比稀释，然后接种定量待测菌株，经过规定时间和温度孵育后，肉眼观察（或借助仪器读取）无可见细菌生长的最低药物浓度，即为该药物对该菌株的MIC值。该方法结果直观，适用于绝大多数需氧菌和兼性厌氧菌，是临床微生物实验室和药物研究中的金标准方法。

检测项目

本试验的核心检测项目即为待测抗菌药物对目标病原微生物的最小抑菌浓度（MIC）。具体包括：

1. 药物种类： 可以测定单一抗菌药物（如青霉素、头孢曲松、左氧氟沙星、万古霉素等）的MIC，也可用于研究联合药物（如β-内酰胺类+酶抑制剂）的协同作用，此时测定的通常是部分抑菌浓度指数（FIC Index）的基础数据。

2. 病原微生物： 适用于需氧菌和兼性厌氧菌，包括革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、肠球菌、肺炎链球菌等）和革兰氏阴性菌（如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等）。对于专性厌氧菌、营养要求苛刻的细菌或真菌，通常需要选用特定的培养基和方法。

3. 培养基： 标准方法是使用阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤（CAMHB）。对于肺炎链球菌、β-溶血性链球菌等需补充2-5%脱纤维羊血或马血的CAMHB。嗜血杆菌属需用嗜血杆菌试验肉汤（HTM）。

检测仪器

营养肉汤稀释法MIC测定主要使用以下仪器和耗材：

1. 微量稀释板： 标准的96孔U形底或平底无菌塑料板。这是进行批量试验最常用的工具。

2. 多通道移液器： 用于高效、准确地转移液体培养基、药物溶液和菌液，特别是进行系列稀释和加样。

3. 菌液浓度比浊仪： 如麦氏比浊仪（McFarland Standards）或自动化分光光度计/比浊计，用于将待测菌液的浊度精确调整至所需标准（通常相当于0.5麦氏标准）。

4. 恒温培养箱： 提供标准化的孵育环境（通常为35±2°C），需确保温度均匀稳定。

5. (可选) 微量板读数仪： 带合适滤光片的酶标仪，可用于客观测定细菌生长引起的浊度变化或在某些方法中检测指示剂（如氧化还原指示剂TTC）的颜色变化，辅助终点判断，尤其适用于自动化判读。

6. 基本实验室设备： 单通道移液器、涡旋振荡器、生物安全柜、无菌吸头、试管等。

检测方法

营养肉汤稀释法（以96孔微量稀释板法为例）的主要步骤：

1. 抗菌药物溶液配制： 用适当溶剂（通常为无菌水或缓冲液）溶解抗菌药物标准品，配制高浓度母液（如≥1000μg/mL或最高测试浓度的10倍），必要时过滤除菌并分装冻存。

2. 药物倍比稀释： 在96孔板中，除第一列（最高浓度）外，其余各孔加入CAMHB培养基。在第一列加入含抗菌药物的培养基（通常为2倍于最高测试浓度）。用多通道移液器从第一列开始进行连续倍比稀释（如1：2），移液时需充分混匀。最后一列通常为不含药物的生长对照孔（Growth Control, GC），并设置培养基无菌对照孔（Sterility Control, SC）。

3. 菌液准备： 挑取纯培养菌落接种于合适肉汤中（通常为CAMHB），在35°C孵育至对数生长期中期（约2-6小时，或达到0.5麦氏浊度）。用肉汤或生理盐水将菌液稀释至最终工作浓度（通常为5×10⁵ CFU/mL）。

4. 接种： 向除SC孔外的所有孔中加入等体积（如50μL）已稀释好的菌液。此时，每孔中抗菌药物的浓度即被稀释一倍，达到最终测试浓度范围（如128μg/mL到0.125μg/mL），菌液终浓度约为5×10⁵ CFU/mL。

5. 孵育： 将微量板加盖或用专用封膜密封，置于35±2°C恒温培养箱中孵育指定时间（通常非苛养菌为16-20小时，肺炎链球菌为20-24小时）。

6. 结果判读： 孵育结束后，在良好光源背景下（或使用读板仪），肉眼观察各孔浊度：

不含抗菌药物的GC孔：应呈现明显浑浊（细菌生长）。
SC孔：应清澈透明（无污染）。
含药孔：与GC孔相比，无肉眼可见生长（清澈透明或仅有轻微沉淀但无浑浊）的最低药物浓度孔，其所对应的浓度即为该药物对该菌株的MIC值。

检测标准

营养肉汤稀释法MIC测定必须严格遵循国际或国家认可的标准化操作指南和质量控制要求，主要标准包括：

1. 国际权威指南：

CLSI M07系列 (Clinical & Laboratory Standards Institute)： 美国临床和实验室标准协会发布的“稀释法抗菌药物敏感性试验方法标准”是北美及全球广泛采用的金标准。详细规定了培养基（CAMHB等）的制备、质量控制、菌液制备、接种量、孵育条件、终点判读规则、质量控制菌株及其预期MIC范围等。
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)： 欧洲抗菌药物敏感性试验委员会标准。与CLSI在基本原则和操作上高度一致，但在某些药物折点（Interpretive Categories: 敏感S、中介I、耐药R）和具体技术细节上可能存在差异。

2. 标准化操作(SOP)： 每个实验室必须基于CLSI或EUCAST标准建立详细的、适合本实验室的标准操作程序(SOP)，并严格执行。

3. 质量控制(QC)： 这是保证结果准确可靠的核心环节：

QC菌株： 每次试验（或每天）必须使用标准QC菌株（如CLSI推荐的E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853等）平行进行MIC测定。
预期范围： QC菌株对特定抗菌药物的MIC值必须在CLSI或EUCAST文件规定的预期范围内。超出范围表明试验过程可能存在误差（培养基、药液、接种量、孵育条件等），该批次患者结果不能报告，必须查找原因并纠正。
培养基和试剂： 新批次培养基、药物、肉汤等需用QC菌株进行验证。

4. 结果解释标准（折点）： MIC测得的数值本身是连续的，但临床决策需要将其转化为“敏感(S)”、“中介(I)”或“耐药(R)”的类别解释。这种转化必须严格依据当前有效的CLSI M100（年度更新）或EUCAST折点表。实验室不得自行设定折点。

严格遵循这些检测标准，是确保MIC测定结果准确、可靠、可比，并最终服务于临床合理用药的关键所在。