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粘杆菌素(A+B)检测

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发布时间：2025-07-01 03:14:17 更新时间：2025-06-30 03:14:17

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

粘杆菌素(A+B)检测概述

粘杆菌素（Colistin），通常指其硫酸盐形式（Colistin Sulfate），是由多粘芽孢杆菌产生的一种多肽类抗生素。其药用成分主要为粘杆菌素A（Colistin A）和粘杆菌素B（Colistin B），两者结构相似但存在微小差异。因其对革兰氏阴性菌，尤其是多重耐药菌（如碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌）具有较强抗菌活性，在兽医和人医领域均有应用。然而，粘杆菌素在食品动物中的滥用可能导致细菌耐药性增强及药物残留，威胁食品安全和公共卫生。因此，对动物源性食品（如肉类、乳制品、蛋类）、饲料及环境样本中粘杆菌素A和B的总量（A+B）进行精准检测至关重要，是保障食品安全、评估用药合规性及监控耐药性发展的关键环节。

检测项目

粘杆菌素(A+B)检测的核心项目包括：

目标物：粘杆菌素A (Colistin A) 与粘杆菌素B (Colistin B) 的总量。通常以粘杆菌素A的当量或总粘杆菌素含量报告结果。
基质范围：
- 食品：猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉、虾、牛奶、鸡蛋、蜂蜜等。
- 饲料：配合饲料、预混料、浓缩饲料。
- 环境样本：养殖场废水、土壤。
- 生物样本：动物组织（肌肉、肝脏、肾脏）、血液、尿液。
检测目的：评估残留水平是否超出法定限量、追溯污染来源、监控养殖用药规范、支持耐药性研究。

主要检测仪器

粘杆菌素(A+B)的痕量检测高度依赖先进的仪器平台：

液相色谱-串联质谱仪 (LC-MS/MS)：目前公认的金标准方法仪器。
- 液相色谱(LC)：通常采用C18反相色谱柱进行分离。超高效液相色谱(UHPLC)因其高效分离和快速分析能力被广泛应用。
- 串联质谱(MS/MS)：三重四极杆质谱(QqQ)是主流选择，因其具有高灵敏度、高选择性和优异的定量能力。在电喷雾离子源(ESI)正离子模式下，监测粘杆菌素A和B特定的母离子及特征子离子对。
高效液相色谱仪 (HPLC)：常与荧光检测器(FLD)或紫外检测器(UV)联用。但灵敏度、选择性和抗干扰能力通常不如LC-MS/MS，适用于限量较高或基质相对简单的样本。
酶联免疫吸附测定仪 (ELISA Reader)：基于抗原抗体特异性反应的免疫学方法。具有快速、高通量、操作简便、成本相对较低的优势，适用于大量样品的快速筛查。但其灵敏度、精密度和抗基质干扰能力一般低于LC-MS/MS，且存在假阳/阴性可能，阳性结果需用确证方法复核。

关键检测方法

检测过程通常包含样本前处理和仪器分析两大步骤：

样本前处理 (至关重要)：
- 提取：常用酸性水溶液（如0.1%甲酸水、三氯乙酸溶液）或含有机溶剂（如乙腈、甲醇）的混合溶液进行提取，将目标物从复杂基质中释放出来。
- 净化：去除共提取的脂肪、蛋白质、色素等干扰物。常用方法包括：
  - 固相萃取 (SPE)：最常用。可选择混合型阳离子交换(MCX)、亲水亲脂平衡(HLB)或专用分子印迹聚合物(MIP)柱进行富集和净化。
  - QuEChERS：快速、简便、经济、高效、耐用、安全的方法，尤其适用于高含水/脂肪样本。通过盐析和吸附剂净化。
  - 液液萃取 (LLE)：有时用于初步净化。
- 浓缩与复溶：净化液常需氮吹浓缩并复溶于适合LC进样的溶剂（如初始流动相）。
仪器分析方法：
- LC-MS/MS法 (确证和定量首选)：
  1. 色谱分离：优化流动相（常用水/乙腈或水/甲醇体系，添加甲酸或乙酸铵调节）和梯度程序，使粘杆菌素A和B与基质干扰物及彼此之间良好分离。
  2. 质谱检测：优化离子源参数(温度、电压、气流)，选择特征性母离子(如粘杆菌素B: m/z 390.8 → 101.2, 241.2; 粘杆菌素A: m/z 585.4 → 101.1, 241.3)，设定最佳的碰撞能量。多反应监测(MRM)模式采集数据。
  3. 定量：采用同位素内标法(如D5-粘杆菌素)进行准确定量，有效补偿前处理和仪器分析过程中的损失和基质效应。
- HPLC-FLD/UV法：粘杆菌素本身荧光较弱或无强紫外吸收，通常需要柱前或柱后衍生化（如邻苯二甲醛(OPA)、芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)）以增强检测信号。
- ELISA法 (快速筛查)：基于竞争性免疫反应原理，样本中的粘杆菌素与酶标抗原竞争结合包被在微孔板上的特异性抗体。通过酶催化底物显色，颜色深浅与待测物浓度成反比。用酶标仪读取吸光度值进行半定量或定量。

主要检测标准

粘杆菌素(A+B)检测需遵循国家或国际认可的标准方法以确保结果的可比性、准确性和法律效力：

中国国家标准 (GB)：
- GB 31650-2019 《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》：规定了粘杆菌素在不同动物源性食品中的最大残留限量(MRLs)。
- GB 31658.XX系列：食品安全国家标准动物性食品中XX兽药残留量的测定。具体检测方法标准不断更新中，已有多个针对粘杆菌素的LC-MS/MS方法标准（如部分涵盖在水产品、畜禽肉、牛奶的检测标准中）。
- 农业农村部公告：如第XX号公告中发布的饲料中粘杆菌素的测定方法等。
国际/区域标准：
- 欧盟(EU)：欧盟委员会法规(EU) No 37/2010规定了粘杆菌素在动物源性食品中的MRLs。参考欧盟基准实验室(EURL)推荐的确证方法（通常为LC-MS/MS）。
- 国际食品法典委员会(CAC)：CAC/MRL 系列标准提供了国际参考的MRLs。
- 美国食品药品监督管理局(FDA)：通过合规政策指南(CPG)等文件规定限量，并认可USDA或FDA实验室方法手册中的方法。
药典方法：如《中华人民共和国兽药典》中可能包含原料药或制剂中粘杆菌素含量的测定方法，但通常不直接适用于复杂基质残留检测。
行业/实验室标准操作程序(SOP)：检测机构在满足国标要求的基础上，会制定更详细、更具操作性的内部SOP。