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医疗机构污水及污泥中志贺氏菌检测

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发布时间：2025-07-06 03:44:51 更新时间：2025-07-05 03:44:51

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

医疗机构污水及污泥中志贺氏菌检测的重要性

医疗机构产生的污水和污泥含有大量致病微生物，其中志贺氏菌（Shigella spp.）是引起细菌性痢疾的主要病原体之一，传染性强，对公共卫生安全构成严重威胁。有效检测并监控医疗机构污水及污泥中志贺氏菌的存在与数量，是切断传播途径、防止水源性传染病暴发、保障环境安全和人群健康的关键环节，也是相关法律法规和环保标准强制要求的重点监测项目。因此，建立科学、准确、高效的检测流程至关重要。

检测项目

核心检测项目即为志贺氏菌（Shigella spp.）。根据监测目的和标准要求，通常需要：

1. 定性检测： 确定在特定体积的污水或重量污泥样品中，是否存在活的志贺氏菌。
2. 定量检测（如适用）： 估算单位体积污水（如每升或每100毫升）或单位重量污泥（如每克或每100克）中志贺氏菌的菌落形成单位数（CFU）。
3. 种类鉴定（必要时）： 区分志贺氏菌的种（如痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌），这对于流行病学调查和溯源有价值。

此外，监测计划中通常还包含其他指示菌或病原菌（如粪大肠菌群、沙门氏菌等）的检测，以综合评价消毒效果和污染风险。

检测仪器

志贺氏菌检测过程中涉及的主要仪器设备包括：

1. 样品前处理设备：
* 均质器/拍击式均质器： 用于污泥样品的充分均质化，释放包裹其中的细菌。
* 离心机： 用于浓缩污水样品中的微生物。
* 滤膜过滤装置及真空泵： 用于污水样品的过滤富集，将微生物截留在滤膜上。
2. 微生物培养设备：
* 恒温培养箱： 提供志贺氏菌生长所需的恒定温度（通常35-37°C）。
* 生化培养箱（必要时）： 用于需要特定气体环境（如CO2）的培养。
3. 分离与鉴定设备：
* 生物安全柜： 所有可能产生气溶胶或涉及活菌的操作必须在此进行，确保操作人员安全并防止污染环境。
* 显微镜： 用于观察菌落形态和革兰氏染色镜检（初步鉴定为革兰氏阴性杆菌）。
* 微生物鉴定系统： 如全自动或半自动生化鉴定仪、MALDI-TOF质谱仪、分子生物学设备（PCR仪、电泳仪等），用于准确的菌种鉴定。
4. 通用实验室设备： 灭菌锅（培养基和器械灭菌）、天平、pH计、冰箱和超低温冰箱（样品和试剂保存）、移液器、培养皿、试管、接种环/针等。

检测方法

医疗机构污水及污泥中志贺氏菌的检测主要采用基于培养的微生物学标准方法，核心步骤通常包括：

1. 样品采集与保存： 严格按照规范采集代表性污水（通常取沉淀后上清液或特定时间混合样）或污泥样品，低温（通常4°C）避光保存并尽快运送至实验室，通常在24小时内检测。
2. 样品前处理：
* 污水： 较大体积（如1升或更多）污水样品需通过膜过滤法（常用0.45μm孔径滤膜）进行富集，或将样品离心浓缩。
* 污泥： 称取一定量（如10g或25g）污泥，加入适量稀释液（如无菌磷酸盐缓冲液PBS或蛋白胨水），经充分振荡或均质形成均匀悬液。
3. 选择性增菌培养： 将富集后的滤膜或污泥悬液（或其适当稀释液）接种到志贺氏菌选择性增菌肉汤中（如GN增菌肉汤）。在35-37°C培养6-24小时（时间依具体方法），抑制杂菌生长，促进志贺氏菌增殖。
4. 选择性平板分离： 取增菌后的培养液划线接种到志贺氏菌选择性鉴别平板上（最常用的是木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂平板，XLD；其他可能用到的有麦康凯琼脂平板MAC、沙门氏菌志贺氏菌琼脂平板SS、HE琼脂平板等）。在35-37°C培养18-48小时。
5. 可疑菌落识别与筛选： 在选择性平板上，志贺氏菌通常呈现无色、半透明、光滑、边缘整齐的菌落（XLD平板上因不发酵木糖呈红色或粉红色中心）。挑取符合特征的可疑菌落。
6. 生化鉴定与血清学分型（验证）：
* 生化试验： 纯化后的可疑菌落进行系列生化试验（如三糖铁试验TSI、赖氨酸脱羧酶试验、动力试验、靛基质试验、尿素酶试验、ONPG试验等）。志贺氏菌典型的生化特性：TSI斜面红/底层黄（不产H2S）、赖氨酸脱羧酶阴性、动力阴性、靛基质可变、尿素酶阴性、ONPG可变（宋内志贺菌阳性）。
* 血清学凝集试验： 符合志贺氏菌生化特征的菌株，需用多价和单价志贺氏菌诊断血清进行玻片凝集试验，以确定具体的血清群和型。这是确认志贺氏菌的关键步骤。
7. 分子生物学方法（作为辅助或确证）： 如聚合酶链式反应（PCR），检测志贺氏菌特异性基因（如ipaH基因等），可用于快速筛查、鉴定或对培养结果进行确证，尤其在分离困难或需要快速结果时。

检测标准

检测活动必须严格遵循国家标准或行业规范，以确保结果的准确性和可比性。中国相关主要标准包括：

1. 《医疗机构水污染物排放标准》（GB 18466-2005）： 这是核心的强制性标准。它规定了医疗机构污水及污泥中粪大肠菌群等指标的排放限值，并明确规定“医疗机构污泥排放时应达到相应标准，并应进行蛔虫卵、粪大肠菌群和细菌总数（医疗机构污泥）或肠道致病菌（主要为沙门氏菌、志贺氏菌）主要指标的检测”。其附录中提供了肠道致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌）的具体检验方法（通常基于多管发酵法或滤膜法结合传统培养鉴定）。
2. 《污水监测技术规范》（HJ 91.1-2019）： 规定了水质（包括污水）样品采集、保存、运输和现场监测的一般技术要求和原则。
3. 《城镇污水处理厂污泥处置农用泥质》（CJ/T 309-2009）等相关污泥处置标准： 在污泥进行土地利用时，会参考此类标准中对病原菌（包括肠道致病菌/细菌）的控制要求。
4. 《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T 5750.12-2023）： 虽然主要针对饮用水，但其附录A或相关章节有时会提供或参考肠道致病菌（包括志贺氏菌）的检验方法（如滤膜法、增菌分离鉴定程序），这些方法经适当调整（如样品前处理）可用于污水和污泥检测。
5. 国际参考方法： 如美国FDA的《Bacteriological Analytical Manual》(BAM)或ISO标准（如ISO 21567:2004 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of Shigella spp.），可作为方法学参考，但具体执行需以中国国标为准。

执行要点： 实验室在进行检测时，必须严格按照现行有效标准中规定的方法程序操作，使用经过检定/校准的仪器设备，使用符合标准的培养基和试剂，人员