皮肤变态反应试验（皮肤/黏膜试验）概述

皮肤变态反应试验（Skin Sensitization Test），也称为过敏性接触性皮炎试验，是评估化学物质、化妆品、医疗器械、药品等外源性物质诱导机体产生迟发型超敏反应（IV型变态反应）潜力的关键毒理学检测手段。该试验通过模拟人体或动物皮肤/黏膜接触受试物后的免疫应答过程，预测其致敏风险，广泛应用于产品安全性评价、职业健康防护及法规注册等领域。试验核心在于识别物质是否具备成为致敏原的潜力，以及量化其致敏强度，为风险评估和标签警示提供科学依据。

皮肤变态反应的发生涉及复杂的免疫机制，主要包括致敏（诱导）和激发两个阶段。在致敏阶段，小分子半抗原穿透皮肤屏障与载体蛋白结合形成完全抗原，被表皮朗格汉斯细胞捕获、加工并提呈给T淋巴细胞，诱导特异性记忆T细胞克隆增殖。在激发阶段，当机体再次接触相同致敏原时，活化的记忆T细胞释放炎症因子，招募效应细胞，导致局部皮肤出现红斑、水肿、丘疹甚至水疱等典型的炎症反应。皮肤变态反应试验正是通过科学设计的模型重现这一过程，评估物质的致敏性。

依据试验载体和目标，皮肤变态反应试验主要分为两大类：体内试验（In Vivo）和体外试验（In Vitro）。体内试验直接在人体志愿者（斑贴试验）或实验动物（如豚鼠、小鼠）的完整皮肤/黏膜上进行；体外试验则利用离体皮肤模型、重组人表皮、或特定细胞系（如树突状细胞、角质形成细胞）在实验室条件下评估物质的致敏潜能。随着3R原则（替代、减少、优化）的推进和技术的进步，体外替代方法正日益成为重要的研究和发展方向。

检测项目

皮肤变态反应试验涵盖一系列具体的检测项目，针对不同的应用场景和测试目的：

1. 人体试验：

• 人体重复性斑贴试验（HRIPT / RIPT）： 评估物质在人体皮肤反复暴露下的致敏风险，常用于化妆品终产品安全性确认。
• 人体最大化试验（HMT）： 采用高浓度和封闭斑贴以最大化激发潜在致敏性，用于新原料或高关注物质的风险筛查。
• 光斑贴试验： 专门评估物质在光照（通常是UVA）条件下引发光敏反应（光毒性或光变态反应）的可能性。
• 黏膜刺激性与过敏性试验： 针对可能接触眼、口腔、生殖器等黏膜部位的产品（如滴眼液、漱口水、避孕产品），评估其在黏膜部位的致敏潜能。

2. 动物试验（传统）：

• 豚鼠最大化试验（GPMT）： 经典的动物模型，通过皮内注射诱导和表皮涂抹激发来评估强致敏原。
• 豚鼠封闭斑贴试验（Buehler Test）： 仅通过表皮涂抹进行诱导和激发，适用于评估较弱致敏原。

3. 体外替代方法（OECD认可）：

• 局部淋巴结试验（LLNA）： 测量小鼠耳部接触受试物后引流淋巴结内淋巴细胞增殖程度（放射性或非放射性方法），量化致敏强度（EC3值）。
• 人细胞系活化试验（h-CLAT）： 利用人源THP-1细胞系（单核细胞/树突样细胞），检测受试物刺激后细胞表面CD86和CD54表达的上调，指示树突细胞活化（致敏关键事件）。
• 直接多肽反应试验（DPRA）： 评估受试物与模型肽（半胱氨酸、赖氨酸）的反应性（共价结合），模拟半抗原化过程。
• ARE-Nrf2荧光素酶试验（KeratinoSens™ / LuSens）： 利用基因工程改造的人角质形成细胞系，检测受试物诱导抗氧化反应元件（ARE）驱动的荧光素酶基因表达，反映Keap1-Nrf2通路激活（皮肤致敏关键事件）。
• 重组人表皮模型试验（如EpiSensA®）： 使用重建的人表皮组织，检测受试物暴露后炎症相关标志物（如IL-18）的释放。

检测仪器

进行皮肤变态反应试验涉及多种精密仪器：

• 斑贴试验器/斑试器： 用于固定受试物到人体或动物皮肤（如Finn Chamber®, IQ Chamber®），材质需惰性（铝、塑料）。
• 封闭敷料： 医用胶带（如Scanpor®）、绷带、专用固定带，确保斑试器贴合且封闭。
• 光源系统： 光斑贴试验专用的紫外线A（UVA）光源设备，精确控制照射剂量。
• 显微镜及图像采集系统： 观察和记录皮肤反应（红斑、水肿评分）及动物淋巴结形态学变化。
• 细胞培养设备： CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、离心机等，用于体外细胞试验。
• 流式细胞仪（FACS）： 检测h-CLAT等试验中细胞表面标志物（CD86, CD54）的表达水平。
• 酶标仪/微孔板读数仪： 用于读取DPRA（HPLC-UV）、LLNA（BrdU或ATP法）、ARE试验（荧光素酶活性）中的吸光度（OD值）、荧光或化学发光信号。
• 高效液相色谱仪（HPLC）： DPRA试验中定量分析模型肽的消耗。
• 液体闪烁计数器或荧光/发光微孔板读数仪： 传统LLNA（放射性）或非放射性LLNA（如BrdU-ELISA, ATP检测）的数据采集。
• ELISA设备： 检测细胞培养上清或组织匀浆中的细胞因子（如IL-18）。

检测方法

不同检测项目有标准化的操作流程，以下简述关键方法：

1. 局部淋巴结试验（LLNA，如OECD TG 429）：

1. 动物准备： 选用雌性小鼠（如CBA/Ca或CBA/J）。
2. 给药：
3. 诱导期： 连续3天在动物双耳背侧涂抹不同浓度的受试物或对照溶剂。
4. 标记： 第5天，静脉注射放射性标记的胸苷（[3H]-TdR）或溴脱氧尿苷（BrdU）或腹腔注射ATP检测试剂。
5. 取样： 第6天，处死动物，摘取双侧耳后引流淋巴结。
6. 测量： 放射性法：液体闪烁计数仪测量淋巴结掺入的放射性强度；BrdU法：ELISA检测淋巴结细胞中BrdU含量；ATP法：检测淋巴结细胞的ATP含量（反映细胞活性/增殖）。
7. 计算刺激指数（SI）：（处理组平均dpm或等效值）/（溶剂对照组平均dpm或等效值）。若SI≥3，且具有剂量反应关系，则判为阳性。计算EC3值（引起SI=3的受试物浓度）。