鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验检测概述

鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验，即著名的Ames试验，是国际上公认且广泛应用的遗传毒性初筛检测方法。该试验由Bruce Ames教授及其团队开发，其设计核心在于利用特定组氨酸营养缺陷型（his-）鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）突变株，在缺乏外源性组氨酸的培养基上不能生长。当受试物具有致突变性时，可诱发这些菌株发生回复突变（回变），使其重新获得合成组氨酸的能力（即变为his+），从而能够在缺乏组氨酸的培养基上形成肉眼可见的回变菌落。哺乳动物微粒体酶（通常是经诱导剂处理的大鼠肝脏匀浆经离心后得到的含细胞色素P450酶系的S9组分）的引入至关重要，它模拟了哺乳动物体内的代谢活化过程，能够将某些本身无遗传毒性但具有潜在遗传毒性的前致突变物（procarcinogens）代谢活化为具有遗传毒性的终致突变物（ultimate mutagens）。因此，Ames试验在评估化学品、药物、食品添加剂、化妆品原料及环境污染物等的潜在遗传毒性和致癌风险方面发挥着不可替代的作用。

检测项目

Ames试验的核心检测项目是受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌特定菌株发生回变的致突变能力。具体检测内容包括：

• 受试物直接致突变性测试： 在不添加S9混合液（即无代谢活化系统）的条件下进行，评估受试物本身是否具有致突变性。
• 受试物间接致突变性测试： 在添加S9混合液（即有代谢活化系统）的条件下进行，评估受试物经哺乳动物酶系统代谢活化后是否产生致突变性。
• 剂量-反应关系测定： 通常至少测试5个浓度梯度，以观察受试物致突变效应是否随浓度增加而增强，并确定是否具有统计学意义的阳性反应。
• 菌株特异性测试： 常规使用一套标准菌株（如TA98, TA100, TA1535, TA1537, TA102等），它们具有不同的突变类型（移码突变、碱基置换突变）和附加突变（如rfa突变使细胞壁通透性增加，uvrB突变使DNA切除修复能力缺失，pKM101质粒增强错误倾向修复），以覆盖广泛的遗传损伤类型。

检测仪器

进行Ames试验需要一系列实验室基础仪器和设备，主要包括：

• 无菌操作设备： 生物安全柜或超净工作台（用于无菌操作）。
• 培养设备： 恒温培养箱（通常设定37±1°C）、恒温水浴锅（用于融化顶层琼脂和保温）。
• 混合与混匀设备： 旋涡混合器（用于混匀菌液、S9混合液、受试物）。
• 样品处理设备： 精密天平（称量受试物）、离心机（制备S9组分）、pH计（调节培养基和试剂的pH）。
• 灭菌设备： 高压蒸汽灭菌锅、干热烘箱（用于培养基、器皿灭菌）。
• 稀释与加样设备： 微量移液器及其吸头、稀释瓶。
• 计数设备： 菌落计数器（手动或自动）、平板扫描仪（用于准确计数菌落）。
• 配制设备： 磁力搅拌器（配制培养基）。
• 耗材： 培养皿（常用直径90mm）、试管、三角瓶、量筒、烧杯等。

检测方法

Ames试验的标准方法主要有两种：平板掺入法和平皿预培养法。其中平板掺入法是最常用且被大多数标准引用的方法，其步骤如下：

1. 菌株准备： 将冷冻保存的特定菌株接种于营养肉汤中，37°C振荡培养至对数生长期晚期（约10⁸~10⁹ cells/mL）。
2. S9混合液准备（如需要）： 临用前按配方配制S9混合液（含S9组分、NADP、G-6-P、盐溶液等），并置于冰浴中。
3. 顶层琼脂准备： 加热融化顶层琼脂（含微量组氨酸/生物素），并保温在45°C水浴中。
4. 加样混合： 在无菌试管中依次加入：
   • 0.1 mL 新鲜菌液
   • 0.5 mL S9混合液（代谢活化组）或0.5 mL 缓冲盐溶液（非代谢活化组）
   • 0.1 mL 受试物溶液/溶剂对照（阴性对照）/阳性对照物溶液
   立即旋涡混匀数秒。
5. 铺板：
6. 将上述混合物迅速加入装有约2 mL 45°C顶层琼脂的试管中，快速混匀后立即倾倒于底层最低葡萄糖基本培养基平板（VBM）上，轻轻旋转平板使顶层琼脂均匀分布。
7. 培养： 待顶层琼脂凝固后，将平板倒置放入37°C恒温培养箱中，避光培养48±2小时。
8. 计数： 培养结束后，计数每块平板上的回变菌落数（his+菌落）。

平皿预培养法与平板掺入法类似，主要区别在于菌液、受试物和S9混合液（或缓冲液）先在较小体积中（如0.5-1mL）混合，在37°C振荡培养20-30分钟（预培养阶段），然后再加入顶层琼脂铺板。

检测标准

Ames试验的操作、结果判定和质量控制需严格遵循国际或国家认可的标准方法学指南，以确保结果的可靠性和可比性。主要标准包括：

• OECD 测试指南 471： 《细菌回复突变试验》。这是全球最广泛采用的国际标准，详细规定了试验原理、菌株要求、试验设计（包括剂量选择、重复数、对照设置）、操作步骤（平板掺入法和平皿预培养法）、数据处理和结果解释标准。
• ISO 16240: 2005： 《水质 - 沙门氏菌/微粒体物质试验（Ames试验）测定遗传毒性》。主要针对水质样品的检测。
• 中国国家标准：
  • GB 15193.4-2014 《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》：中国食品安全领域的强制性标准。
  • GB/T 21794-2008 《化学品 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法》：虽然标题是染色体畸变，但其中引用了Ames试验作为遗传毒性筛选方法，实际执行通常遵循OECD 471原则。
  • 新化学物质申报等环节也常要求按照OECD 471进行。
• ICH S2(R1)： 《人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则》。该指导原则强烈推荐使用Ames试验作为药物遗传毒性评价标准组合的一部分。

结果判定标准（依据OECD 471等）： 受试物在任何一个菌株、任何一个试验条件下（无论有无S9），只要满足以下条件之一，通常认为具有致突变性（阳性）：

1. 回变菌落数呈现剂量相关性增加（有统计学意义，如趋势检验显著）。
2. 在任何一个剂量点，回变菌落数达到或超过溶剂对照（阴性对照）回变菌落数的2倍（对于TA1535, TA1537）或3倍（对于TA98, TA100, TA102等），且具有统计学显著性（如p<0.05）和可重复性（通常要求有明确剂量反应关系或在至少两个独立试验中重现）。

同时必须满足阴性对照的回变菌落数在本实验室历史数据范围内，阳性对照的回变菌落数显著增加。

检测机构资质证书

CMA认证

检验检测机构资质认定证书

证书编号：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS认可

实验室认可证书

证书编号：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO认证

质量管理体系认证证书

证书编号：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

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