体外细胞毒性试验-直接接触试验检测

体外细胞毒性试验是评价医疗器械、生物材料、药品及其成分潜在生物相容性的关键手段之一，其中直接接触试验是应用最为广泛且重要的方法。该试验模拟材料或器械在临床使用中与其直接接触的细胞或组织可能发生的相互作用，通过将待测样品直接置于培养的细胞单层上，评估其对细胞形态、增殖、代谢活性等的影响，从而预测其潜在的体内毒性风险。直接接触试验因其直观性和相对较高的敏感性，尤其适用于评估表面接触的医疗器械（如植入物、导管、敷料）以及与细胞紧密接触的材料。

检测项目

直接接触试验的核心检测项目围绕细胞对直接接触材料的反应展开，主要包括：

1. 细胞形态学观察： 在显微镜下（通常为倒置光学显微镜）直接观察与样品接触后细胞的形态变化，如细胞圆缩、皱缩、裂解、空泡化、颗粒化、脱落等异常的细胞毒性反应。
2. 细胞活性定量检测： 利用特定的染色方法或生物化学试剂，定量测定接触样品后活细胞的数量或比例，以及细胞代谢活性的变化。最常用的方法是MTT/XTT/WST-1比色法（检测线粒体脱氢酶活性）或中性红摄取法（检测溶酶体活性）。
3. 细胞增殖抑制率： 通过比较接触组与对照组细胞的增殖情况（如通过细胞计数或DNA含量测定），计算样品对细胞增殖的抑制程度。
4. 细胞死亡模式分析（可选）： 可通过流式细胞术结合Annexin V/PI双染等方法，初步区分细胞凋亡与坏死。

检测仪器

进行体外细胞毒性直接接触试验需要以下主要仪器设备：

1. 超净工作台/生物安全柜： 提供无菌操作环境。
2. 细胞培养箱： 维持恒定的温度（37°C）、湿度（>90%）和二氧化碳浓度（通常5% CO2）。
3. 倒置光学显微镜： 用于观察细胞形态和样品接触情况。
4. 酶标仪： 用于读取比色法（MTT/XTT/WST-1/中性红等）的吸光度值（OD值），定量细胞活性。
5. 离心机： 用于细胞悬液的制备。
6. 移液器： 精确移取液体。
7. 细胞培养耗材： 如培养皿、多孔培养板（最常用96孔板）、离心管、移液管等。
8. 天平： 用于精确称量样品（如薄膜、颗粒等）。
9. 流式细胞仪（可选）： 用于进行更深入的细胞死亡分析。

检测方法

典型的直接接触试验操作流程如下：

1. 细胞准备： 选择适当的哺乳动物细胞系（如L929小鼠成纤维细胞、V79中国仓鼠肺细胞、人源细胞等），在含血清培养基中常规传代培养。将处于对数生长期的细胞消化、计数，以适宜的密度（通常使次日形成约80-90%融合度的单层细胞）接种于多孔培养板（如96孔板）中，置于培养箱中过夜培养使其贴壁。
2. 样品处理与放置： 将待测样品（固体材料需灭菌，并切割/制备成适合放置在孔内且不漂浮的尺寸，如薄膜、小片、颗粒；液体产品或浸提液直接滴加）小心地直接放置在孔内已贴壁的细胞单层中央。确保样品与细胞层充分接触但避免划伤细胞。设置空白对照组（仅含培养基和细胞）、阴性对照组（已知无毒材料，如高密度聚乙烯、特氟隆膜）和阳性对照组（已知有毒物质，如含锌有机化合物、乳胶）。
3. 共培养： 将培养板放回培养箱中继续培养一定时间（通常为24小时或48小时）。
4. 显微镜观察（形态学评价）： 共培养结束后，在显微镜下直接观察各孔中细胞形态的变化，特别是紧邻样品边缘及下方的细胞，按预先设定的评分标准（如0级：无细胞毒性；1级：轻微反应；2级：中等反应；3级：重度反应；4级：完全破坏）进行定性或半定量评价。
5. 细胞活性定量检测：

• MTT法： 小心移除培养液（注意避免扰动样品和细胞），每孔加入含MTT（四甲基偶氮唑盐）的无血清培养基溶液，继续孵育数小时（如2-4小时）。弃去MTT溶液，每孔加入有机溶剂（如DMSO、异丙醇）溶解细胞内生成的蓝紫色甲臜结晶。用酶标仪在特定波长（如570nm，参考波长630nm）下测定吸光度值（OD值）。
• 中性红法： 移除培养液，PBS洗涤，加入含中性红的培养液，孵育数小时（如2-3小时）。快速洗涤去除未摄入的中性红，加入细胞固定剂（如福尔马林/乙醇混合液）固定细胞，再加入脱色剂（如含醋酸的乙醇溶液）溶解细胞内摄入的中性红。用酶标仪在特定波长（如540nm）下测定吸光度值。

检测标准

体外细胞毒性试验，特别是直接接触法，主要遵循以下国际和国内标准：

1. ISO 10993-5: Biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
这是医疗器械生物相容性评价的核心国际标准之一。该标准详细规定了体外细胞毒性试验的通用要求、试验方法（包括浸提液试验和直接接触试验）、细胞系选择、试验步骤、结果评价标准（推荐基于细胞活性降低的评价体系）等。它明确指出，对样品进行直接接触试验是评估其潜在局部细胞毒性的有效方法。通常认为，当细胞存活率≥70%时（相对于阴性对照），反应不大于“轻微”（Grade 1），认为样品无潜在细胞毒性风险；细胞存活率在50%-70%之间为“轻微反应”（Grade 2）；低于50%则毒性反应显著增强（Grade 3或4）。
2. GB/T 16886.5-2017： 医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验
这是中国国家标准，等同采用ISO 10993-5。其内容与ISO 10993-5完全一致，是国内进行医疗器械体外细胞毒性评价（包括直接接触试验）的强制性依据。
3. USP <87> Biological Reactivity Tests, In Vitro
美国药典通则<87>也提供了体外细胞毒性试验的指导，包括直接接触试验（琼脂扩散法或直接接触法）。其评价标准与ISO 10993-5类似，但具体的细胞系和琼脂扩散法有特定要求。

遵循这些标准进行体外细胞毒性直接接触试验，能够为医疗器械和生物材料的安全性评价提供重要且可靠的科学依据。值得注意的是，该试验结果需要结合其他生物学评价试验（如刺激与致敏、全身毒性、植入试验等）以及产品预期用途进行综合风险评估。

检测机构资质证书

CMA认证

检验检测机构资质认定证书

证书编号：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS认可

实验室认可证书

证书编号：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO认证

质量管理体系认证证书

证书编号：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

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