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表面微生物（接触碟法）检测

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发布时间：2025-08-01 19:07:56 更新时间：2025-07-31 19:07:56

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

表面微生物（接触碟法）检测

在制药、医疗器械、食品生产、洁净室环境控制以及医疗保健等领域，对物体表面的微生物污染水平进行有效监控是确保产品质量和操作安全的关键环节。表面微生物检测旨在评估清洁和消毒程序的效力，识别潜在的污染源，并验证生产环境的卫生状况是否符合法规要求。在众多表面采样方法中，接触碟法（Contact Plate Method）因其操作简便、定量性好、对表面损伤小等优点，已成为快速评估规则、平整表面微生物污染的最常用技术之一。该方法的核心在于使用特制的、内含固体培养基的培养皿（接触碟），通过直接接触采样表面，将可能存在的微生物转移到培养基上，经孵育后形成可见菌落进行计数和分析。

检测项目

接触碟法主要检测项目通常包括：

需氧菌总数（Total Aerobic Microbial Count, TAMC）： 评估表面需氧微生物（包括细菌和酵母菌）的总体污染水平，是最基础的微生物负荷指标。
霉菌和酵母菌总数（Total Combined Yeasts and Molds Count, TYMC）： 在特定环境（如潮湿区域、或对霉菌敏感的区域）或产品需求时进行监测。
特定指示菌或致病菌（如适用）： 根据风险评估或法规要求，可能需要对特定微生物（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌等）进行筛查或定量。但这通常需要额外的增菌、分离和鉴定步骤。

检测仪器与耗材

进行接触碟法检测所需的核心仪器与耗材包括：

接触碟（Contact Plates）： 特制的培养皿，通常直径约55mm（如RODAC Plate - Replicate Organism Detection And Counting），内装约15-18ml的琼脂培养基。培养基表面呈凸起的穹顶状，确保与待测表面充分、均匀接触。常用培养基有：
- 胰酪大豆胨琼脂（Trypticase Soy Agar, TSA）： 用于需氧菌总数计数。
- 沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud Dextrose Agar, SDA）或马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）： 用于霉菌和酵母菌计数。
- （可选）含中和剂的培养基：如TSA或SDA中添加卵磷脂和聚山梨酯80（Lecithin and Polysorbate 80），用于中和采样表面可能残留的消毒剂。
恒温培养箱（Incubators）：
- 用于培养需氧菌和酵母菌：通常设定在 30-35°C。
- 用于培养霉菌和酵母菌：通常设定在 20-25°C。
菌落计数器（Colony Counter）： 辅助进行菌落计数。
无菌操作工具： 如无菌镊子（用于操作接触碟）、酒精棉球、记号笔等。
计时器： 确保接触时间标准化。

检测方法

接触碟法操作步骤如下：

准备工作： 选择符合检测目的（TAMC或TYMC）和可能含中和剂的接触碟。从冷藏环境中取出，平衡至室温（避免冷凝水影响接触和微生物复苏）。在碟盖上清晰标记采样点编号、日期等信息。
表面准备： 确保待测表面已按正常程序清洁消毒，并达到规定的作用时间。采样前表面应干燥（除非方法验证接受潮湿表面）。
无菌操作： 操作人员佩戴无菌手套或使用无菌镊子，小心打开接触碟盖，避免触碰琼脂表面或碟盖内侧。
采样操作： 迅速将琼脂表面（凸面）平稳、均匀地压在待测表面上。施加适度且恒定的压力（避免琼脂破裂），保持接触时间通常为 5-10 秒（需根据验证或标准操作程序SOP确定）。接触过程中避免移动或摩擦接触碟。
取回与覆盖： 平稳、垂直地将接触碟从表面提起，立即盖上碟盖。
培养：
- 用于TAMC的接触碟（如TSA）：倒置置于30-35°C恒温培养箱中培养 3-5天（具体天数依据采纳的标准，如药典规定）。
- 用于TYMC的接触碟（如SDA）：倒置置于20-25°C恒温培养箱中培养 5-7天（具体天数依据采纳的标准）。
计数与报告： 培养结束后，立即计数琼脂表面的菌落形成单位（CFU）。可使用菌落计数器辅助。报告结果通常为每个接触碟的CFU数（CFU/plate）。对于蔓延菌落（spreader）的处理，需参照采用的标准规定（如USP <61> 有具体指导）。

检测标准

表面微生物（接触碟法）检测的执行与结果判定需遵循相关国家、国际或行业标准及法规，常见标准包括：

ISO 18593:2018： 《食品和动物饲料微生物学 - 表面取样的水平方法》 - 提供了包括接触碟法在内的多种表面微生物采样方法的详细指南。
中国药典： 现行版药典（如ChP 2020）的“非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”指导原则以及“9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则”中，对洁净区表面微生物监测（常推荐接触碟法）有明确要求，包括采样点选择、频率、培养条件、结果计算和限度标准。不同洁净级别（A/B, C, D）有不同的可接受限度（通常以CFU/碟或CFU/25cm²表示）。
美国药典（USP）： USP <1116> “Microbiological Control and Monitoring of Aseptic Processing Environments” 详细阐述了洁净室环境（包括表面）的微生物监测策略和方法，包括接触碟的应用和结果解读。
欧盟 GMP 附录 1： “无菌药品生产” 最新版对洁净室和隔离器的环境监测提出了严格要求，包括表面微生物监测（推荐接触碟法），并规定了不同等级区域的行动限和警戒限。
PIC/S 指南： 类似欧盟GMP要求。
行业特定标准： 医疗器械（如ISO 11737系列）、食品等行业也有相应的表面微生物检测标准。

执行检测时，必须严格遵循所采纳的标准和本实验室经过验证的标准操作程序（SOP），并确保检测环境（如洁净度）和人员操作符合要求，以保证结果的准确性和可靠性。结果需与既定的可接受标准（如警戒限Action Level和纠偏限Alert Level）进行比较，超出标准时需启动偏差调查及纠正预防措施（CAPA）。