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无菌性检测

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发布时间：2025-08-04 18:58:49 更新时间：2025-08-03 18:58:49

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

无菌性检测：保障产品安全的关键屏障

无菌性检测是医药、生物制品、医疗器械、食品、化妆品等行业中至关重要的质量控制环节。其核心目标是确认最终产品或特定成分中是否含有活的微生物（包括细菌、真菌、酵母等）。对于直接注入人体血液系统、植入体内或用于严重创伤处的产品（如注射剂、输液、植入性器械、眼用制剂等），无菌性是其安全有效的绝对底线要求。任何活微生物的存在都可能引发严重的感染、脓毒症甚至危及生命。因此，无菌性检测不仅是法规强制要求，更是企业质量体系中对患者安全和产品信誉的根本保障。它贯穿于产品研发、生产过程控制、最终产品放行以及稳定性考察的全生命周期。

主要检测项目

无菌性检测的核心项目就是确认供试品在规定的培养条件下无微生物生长。具体可能包括：

1. 最终产品无菌检查： 对批次的最终成品进行抽样，检测其整体或代表性部分是否无菌。这是产品放行的关键依据。

2. 关键原材料/组分无菌检查： 对生产过程中使用的、本身要求无菌或对最终产品无菌性有重大影响的原材料（如注射用水、某些辅料、初包装材料）进行检测。

3. 灭菌工艺验证/再验证中的无菌检查： 在进行灭菌工艺（如湿热灭菌、干热灭菌、辐射灭菌、环氧乙烷灭菌、过滤除菌）的开发、验证或周期性再验证时，通过无菌检查确认灭菌效果是否达到预期（通常需要挑战性试验）。

4. 无菌工艺模拟试验（培养基模拟灌装试验）： 对于采用无菌生产工艺（如无菌过滤+无菌灌装）的产品，定期进行模拟试验，用培养基代替产品模拟整个生产过程，然后进行无菌培养，以评估无菌工艺的可靠性和人员操作的合规性。

5. 环境的无菌监控： 虽然严格来说是对洁净环境微生物水平的监控（如沉降菌、浮游菌、表面微生物），但其结果直接影响产品无菌性，是无菌保证体系的重要组成部分。

关键检测仪器与设备

进行准确可靠的无菌性检测，高度依赖于特定的、符合要求的仪器设备和环境：

1. 无菌检查隔离器/生物安全柜/超净工作台： 提供局部A级（ISO 5）单向流洁净环境，保护样品在检测操作过程中免受环境微生物的污染（假阳性风险）。隔离器更常用于高致敏性或高风险产品的检测。

2. 薄膜过滤装置： 最常用的样品处理设备。包含可灭菌的滤杯（开放式或封闭式）、真空/压力泵系统、集菌仪等。用于将供试液通过孔径≤0.45µm的微孔滤膜过滤，将可能存在的微生物截留在滤膜上。

3. 培养箱： 需具备精确的温度控制和均匀性。通常需要：
- 细菌培养箱： 设定在30-35°C（常用32.5°C ± 2.5°C），用于需氧菌和厌氧菌的培养。
- 真菌/酵母培养箱： 设定在20-25°C（常用22.5°C ± 2.5°C）。

4. 高压蒸汽灭菌器： 用于培养基、稀释液、实验器具（如滤杯、镊子、剪刀、注射器）、实验服等的灭菌处理。必须经过验证，确保灭菌效果。

5. 恒温水浴锅/微波炉： 用于培养基的加热溶解。

6. pH计： 用于培养基pH值的测定（如适用）。

7. 环境监控设备： 如浮游菌采样器、沉降菌培养皿、表面接触碟/拭子、粒子计数器等，用于监控检测实验室（特别是无菌操作区）的环境符合性。

8. 微生物鉴定系统（必要时）： 若在无菌检查中检出微生物污染，需要进行微生物鉴定以追溯污染源。

核心检测方法

现行的无菌性检测主要依据药典方法，以培养法为主：

1. 薄膜过滤法： 这是目前最常用、适用性最广的方法。
- 原理： 将规定量的供试品溶液（或直接溶解/分散的供试品）通过无菌的微孔滤膜（孔径通常为0.45µm或0.22µm）过滤。理论上，样品中存在的微生物会被截留在滤膜表面。
- 操作： 用适量的无菌稀释液冲洗滤膜，以去除可能的抑菌性残留物。然后将滤膜转移至（或直接在滤筒内加入）规定的培养基中，或将其分成若干部分分别放入不同的培养基。
- 优点： 可检测大体积样品，能有效消除样品中抑菌成分的干扰（通过冲洗），灵敏度相对较高。

2. 直接接种法：
- 原理： 将规定量的供试品直接等量接种到两份适量的不同培养基中。
- 操作： 适用于无法过滤或过滤困难的样品（如油剂、软膏、栓剂、某些医疗器械）。
- 缺点： 样品体积受限，样品中的抑菌成分可能干扰微生物生长导致假阴性，灵敏度相对较低。

核心培养基：
- 硫乙醇酸盐流体培养基 (Fluid Thioglycollate Medium, FTM)： 用于培养需氧菌和厌氧菌。其浅层氧化层利于需氧菌生长，深层缺氧层利于厌氧菌生长。培养温度通常在30-35°C。
- 胰酪大豆胨液体培养基 (Tryptic Soy Broth, TSB / Soybean-Casein Digest Medium, SCDM)： 用于培养需氧菌和真菌。培养温度通常在20-25°C。
- 选择性培养基： 必要时（如特定产品或方法适用性试验失败时）可能用到，如选择性厌氧培养基、添加中和剂的培养基。

培养与观察：
- 接种后的培养基在规定温度下培养至少14天。
- 在培养期间（通常在接种后的第3、5、7天，以及结束时）定期观察培养基是否出现浑浊（指示微生物生长）。
- 对于薄膜过滤法，若滤膜上有菌落生长但培养基不浑浊，也视为阳性。
- 14天内培养基保持澄清（或滤膜无菌落），判为无菌检查合格。若任何一份培养基出现浑浊（或滤膜有菌落），需按规程进行复试或调查。

方法适用性试验： 在首次对某产品进行无菌检查或产品的处方、生产工艺、检测条件发生变更时，必须进行方法适用性试验（也称抑菌性检查）。目的是确认所使用的无菌检查方法（包括供试液制备、稀释/冲洗液、冲洗量、培养条件等）能有效消除供试品潜在的抑菌活性，保证即便有微生物存在也能被检出，避免假阴性结果。

遵循的检测标准

无菌性检测必须严格遵循国家或国际官方药典和标准的规定，主要依据包括：

1. 中国药典 (ChP)： 通则<1101> 无菌检查法。详细规定了无菌检查的适用范围、环境要求、方法（薄膜过滤法、直接接种法）、培养基、培养条件、灵敏度检查、方法适用性试验、结果判断等。是中国境内药品和生物制品无菌检查的法定标准。

2. 美国药典 (USP)： 通则<71> Sterility Tests。是国际广泛认可的标准，与ChP和EP在核心原则上高度一致，但可能在细节（如培养基名称、培养温度范围、部分操作细节、方法适用性试验要求）上略有差异。

3. 欧洲药典 (EP)： 2.6.1 Sterility。欧盟地区的法定标准。

4. 日本药局方 (JP)： 4.06 Sterility Test。

5. 医疗器械标准：
- ISO 11737-2:2019 Sterilization of health care products — Microbiological methods — Part 2: Tests of sterility performed in the definition, validation and maintenance of a sterilization process