稳定同位素iTRAQ标记

稳定同位素iTRAQ标记是一种依托同位素编码试剂与串联质谱联用的定量分析技术，检测对象覆盖血清、血浆、组织裂解液、细胞及精子等生物样品中的氨基酸谱与蛋白质组。检测维度氨基酸绝对定量、差异蛋白筛选、方法学性能评估与多指标联检数据解读，为代谢紊乱、肝病、关节疾病及肿瘤相关研究提供可靠的定量支撑。

技术概述

iTRAQ（同位素标记相对和绝对定量技术）采用同位素编码试剂对多肽氨基端及赖氨酸侧链进行标记，可在一次质谱分析中并行比较多组样品的蛋白丰度。同类稳定同位素标记试剂（如DiART）在定量特征上与之相近，均以报告基团与平衡基团的质量守恒为基础。该技术兼具相对定量与绝对定量能力，兼容各类生物样品，是当前定量蛋白质组学与氨基酸代谢谱分析的主流方法之一。

检测原理与定量机制

标记试剂由报告基团、平衡基团与反应基团构成。反应基团与肽段氨基发生共价结合；不同通道的报告基团质量各异，平衡基团则补偿质量差，使同一肽段在各通道中总质量相同。经液相色谱分离后，串联质谱在碎裂过程中释放低质量区报告离子，其峰面积之比即为各样品中该肽段的相对丰度。据此可对目标蛋白或氨基酸进行相对比较，若引入已知浓度的稳定同位素内标，则可实现绝对定量。

样本类型与采集要求

常规样品血清、血浆、组织匀浆、体外培养细胞、精子及食用菌等外源样品。血清采集建议使用惰性分离胶采血管，静置离心后分离上清，避免溶血与反复冻融。组织样品需低温条件下匀浆裂解，细胞样品须计数后统一裂解体积。所有样品均应于低温保存并干冰运输。样品制备环节须剔除高丰度蛋白干扰或进行除盐、酶解处理，以适配后续标记反应的化学计量要求。

iTRAQ联合液相色谱-质谱法

该流程依次蛋白提取与定量、胰蛋白酶酶解、iTRAQ试剂标记、等量混合、二维液相色谱分级与串联质谱检测。第一维常采用强阳离子交换色谱分离肽段，第二维以反相色谱进行细分离，质谱采集碎裂谱图后经数据库检索完成蛋白鉴定与定量。此组合策略可提高肽段覆盖度，降低共洗脱干扰，适用于血清、细胞及组织等复杂基质的蛋白质组比较分析，亦可用于细胞信号通路调控蛋白的鉴定。

氨基酸定量检测——HPLC-MS/MS法

针对小分子氨基酸，可先将iTRAQ试剂与氨基酸的氨基反应生成衍生物，再以高效液相色谱-串联质谱在多反应监测模式下定量。经方法优化后，单次进样可覆盖数十种氨基酸，文献报道体系可达42种。该法将衍生化与质谱高选择性结合，适用于药物性肝损伤等状态下血清氨基酸谱变化的定量分析，亦可用于红菇等食用材料中游离氨基酸的测定，前处理须配合同位素内标校正基质效应。

蛋白质组学差异蛋白筛选

对标记定量结果进行统计学检验与倍数变化筛选，可获得组间差异表达蛋白。结合生物信息学注释，可对差异蛋白进行功能富集与通路分析。该策略已应用于膝骨性关节炎、类风湿关节炎、糖尿病、急性心肌梗死动物模型、弥漫性轴索损伤及胃癌、肺腺癌、肝癌细胞等多种研究场景的血清或细胞标志物筛选，也用于复发性流产男性配偶精子蛋白质组的比较研究。检测服务层面，交付内容通常鉴定蛋白列表、定量比值与差异蛋白清单。

检测性能指标：灵敏度与重复性

方法学评估涵盖线性范围、检出限、定量限、日内与日间精密度、加标回收率及通道串扰水平。氨基酸定量以标准曲线相关系数、回收率与保留时间稳定性作为核心指标；蛋白组定量则以肽段与蛋白鉴定数、重复样品定量比值的中位变异系数衡量。标记效率须在混合进样前核验，未达标的样品应重新标记。批次效应可通过统一前处理、随机分组与共用内标通道加以控制。

联检指标与数据解读

氨基酸谱检测指标必需氨基酸、非必需氨基酸、支链氨基酸及芳香族氨基酸浓度，以及支链氨基酸与芳香族氨基酸比值等衍生参数。蛋白组指标蛋白丰度比值、差异蛋白数量及通路富集结果。解读时须结合临床背景或研究设计，区分代谢改变与样本处理引入的变异。多通道并行比较时，应以同一批次内部比值为主，避免跨批次直接比较绝对信号强度。

适用场景与送检须知

适用于代谢性疾病、肝损伤、关节退行性病变、心脑血管损伤及肿瘤相关研究的血清样品检测，亦支持细胞、精子、卵母细胞及食品原料的蛋白组与氨基酸谱分析。送检前应明确分组设计、通道分配与生物学重复数，通常每组不少于三个独立样品。须填写样品类型、保存条件与检测指标清单。样品量依项目而定，血清一般需满足最低体积要求，组织与细胞样品须标注来源与处理方式。

检测报告与结果判定标准

检测报告一般载明检测方法、样品信息、质谱参数、鉴定与定量结果、标准曲线信息及质控结论。氨基酸定量结果以浓度形式报告，并附参考区间或对照比较；蛋白组结果以蛋白列表、肽段证据及差异蛋白统计结果呈现。结果判定以方法学验证指标合格为前提，结合组间统计学检验与预设阈值判定差异是否成立。对存疑数据，实验室应依据原始谱图复核并出具补充说明。

关于我们

合作客户