rrbs亚硫酸氢盐测序

rrbs亚硫酸氢盐测序（简并代表性亚硫酸氢盐测序）是一种针对基因组DNA甲基化状态的靶向高通量检测技术。该技术借助限制性内切酶富集CpG密集区域，经亚硫酸氢盐转化后进行测序，可在控制数据量的前提下覆盖启动子、CpG岛等甲基化热点区域。本文按检测原理、样本制备、文库构建与测序流程、性能指标、生信分析判定及送检建议六个模块展开，为委托方建立对该方法全流程的认知。

检测原理与机制

亚硫酸氢盐处理可使未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），经PCR扩增后表现为胸腺嘧啶（T）；而5-甲基胞嘧啶在该条件下保持不变。测序后比对参考基因组，依据C与T的 reads 比例即可推算单个位点的甲基化水平。RRBS在此基础上引入酶切富集策略：以MspⅠ等识别CCGG位点的限制性内切酶消化基因组DNA，选择特定长度范围的酶切片段进行文库构建。此类片段在基因组中与CpG岛、启动子区域富集相关，从而以较低测序数据量获得目标区域的高深度覆盖。

样本类型与制备要求

适用于基因组DNA质量完好的多种样本类型，全血、组织块、石蜡包埋组织、脱落细胞、培养细胞及流式分选细胞等。DNA总量一般需达到纳克级，具体随文库制备试剂盒灵敏度而定。样本制备要点：采用酚氯仿法、柱纯化法或磁珠法提取基因组DNA；以分光光度法与荧光法评估纯度和浓度，OD260/OD280宜在1.8左右；以琼脂糖凝胶电泳验证完整性，石蜡样本需关注片段化程度。血红素等抑制物残留会影响酶切与转化效率，须纯化去除。样本采集后应低温保存并尽快送检，避免反复冻融。

文库构建与测序流程

流程依次为基因组DNA质检、MspⅠ酶切、末端修复与加A、甲基化接头连接、片段大小筛选、亚硫酸氢盐转化、PCR扩增、文库质控与上机测序。接头与扩增引物均经甲基化修饰，以免自身序列在转化环节发生化学改变。片段筛选环节常采用磁珠分选或凝胶回收，截取目标长度区间，富集CpG密集片段。转化后DNA单链化且碱基组成失衡，须采用耐受低复杂度模板的专用聚合酶扩增。文库质检涵盖浓度测定与片段分布分析，合格后于第二代测序平台执行单端或双端测序。

检测性能指标

该方法的性能通常从覆盖度、转化效率、重复性与检出限四个维度评价。转化效率指未甲基化C转化为T的比例，以未甲基化Lambda DNA对照评估，一般应不低于99%，否则将引入甲基化水平高估偏差。覆盖度指目标CpG位点被测reads覆盖的比例，与酶切片段筛选策略及测序深度相关。重复性以生物学重复样本间甲基化水平的相关性衡量。检出限涉及起始DNA投入量与降解样本适用性。检测报告中应载明各环节质控数据，文库产量、片段分布、测序数据量、比对率及覆盖CpG位点数量。

生信分析与判定标准

生信分析流程原始数据质控、去除接头序列与低质量碱基、经亚硫酸氢盐基因组比对工具定位至参考基因组、去重、甲基化位点calling及差异分析。比对前需将参考基因组进行C到T与G到A的双重转换，以兼容转化后的序列。位点甲基化水平以该位置C reads占总reads比例表示，通常要求覆盖reads数达到设定阈值方可纳入统计。差异甲基化分析采用统计学检验并结合多重校正，依据甲基化差异幅度与校正后显著性筛选差异位点或差异区域。结果以甲基化水平图谱、差异CpG位点及差异区域注释形式呈现，注释涵盖基因元件与CpG岛位置关系。

适用场景与送检建议

RRBS适用于多种研究与应用场景：疾病分组的表观遗传差异筛查、药物处理前后甲基化变化评估、发育与分化过程中的甲基化动态监测，以及多样本、预算受限情况下的甲基化组级检测。相对于全基因组亚硫酸氢盐测序，其优势在于以有限数据量覆盖CpG富集区域，适合大样本队列。送检前建议明确分组设计、生物学重复数量及目标区域；提供样本类型、提取方式与保存条件信息；DNA样本附浓度与完整性数据。石蜡样本与微量样本应预先与实验室沟通可行性，以保证酶切、转化与文库构建各环节质量。

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