真菌ITSrDNA鉴定是以核糖体DNA内转录间隔区为分子靶标的真菌种类鉴定技术。该区域在物种间变异丰富、在种内相对保守，被誉为真菌条形码的首选序列。检测流程覆盖样本制备、核酸提取、PCR扩增与测序、序列比对分析等模块，并可延伸至菌株鉴定与药敏联合检测。本文按操作步骤阐述各环节技术要点、性能指标与适用场景，为临床感染病原诊断、环境真菌监测及科研分类研究提供方法学参考。
原理与适用范围
真菌核糖体DNA由18S、5.8S、28S亚基及ITS1、ITS2两个内转录间隔区构成。间隔区不受成熟rRNA功能约束，进化速率高于编码区，种间差异明显，适用于真菌物种水平的区分。检测时以ITS1或ITS4等通用引物扩增ITS1-5.8S-ITS2全长片段，测序后与参考数据库比对，依据序列相似度判定物种归属。适用范围涵盖临床标本中致病真菌鉴定、食品及药品中污染真菌筛查、环境与农业样本真菌群落分析，以及丝状真菌与酵母菌的分类学研究。对于某些种间序列差异不足的属，如曲霉属部分近缘种，可联合其他靶基因辅助确认。
样本类型与采集要求
常见样本纯培养菌落、血液、痰液、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、脓液、组织活检材料，以及食品、土壤、水体等环境样品。临床标本应无菌采集并置于密闭容器，组织样本需同时保留一份做组织病理与真菌染色对照。培养物应挑取新鲜菌丝体或孢子，避免老化菌体因核酸降解影响扩增。采样过程须执行无菌操作，防止环境真菌气溶胶污染。所有样本应标注来源与采集时间，冷藏运送，未经固定处理的标本尽早送检。含大量PCR抑制物的标本，如血液与痰液，需经相应前处理后再行核酸提取。
PCR扩增与测序流程
检测流程依次为核酸提取、浓度与纯度测定、引物扩增、产物电泳验证与测序。核酸提取采用机械破壁联合试剂盒法，酵母与丝状真菌细胞壁坚韧，需以玻璃珠振荡或液氮研磨辅助破碎。提取后用分光光度法测定核酸浓度，并以琼脂糖凝胶电泳确认完整性。PCR反应以ITS通用引物进行扩增，扩增产物经凝胶电泳检查，出现预期大小条带且阴性对照无扩增方可进入测序。测序采用Sanger毛细管电泳法，正反向测序后拼接为一致序列，经质量修剪去除低可信末端碱基，获得用于比对的干净序列。
灵敏度与测序准确性指标
方法学性能主要考察检测限、扩增效率与序列质量三个层面。检测限与样本中真菌载量、核酸提取效率及基质抑制物含量密切相关，纯培养菌落的检出能力优于复杂基质样本。序列质量以Q值衡量，测序峰图应基线平稳、信噪比良好，正反向序列一致性高。鉴定结果的可靠性依据比对相似度与序列覆盖度综合判定，相似度高且覆盖完整的序列方可给出种水平结论。近缘种序列差异不足时，报告应降级至属或复合种水平，并注明鉴定限度，避免过度判定。每批次检测均应设置阴性对照与阳性参照，以监控污染与扩增体系稳定性。
菌株鉴定与药敏联检
ITSrDNA鉴定明确病原真菌种类后，可联合体外药敏试验指导抗真菌治疗。药敏检测常用微量肉汤稀释法与琼脂扩散法，测定菌株对唑类、棘白菌素类、多烯类及氟胞嘧啶等抗真菌药物的敏感性，以最低抑菌浓度表述结果。不同真菌对药物的敏感性谱存在差异，例如某些念珠菌属物种对氟康唑存在固有耐药倾向，分子鉴定结果直接指导药敏药物 panel 的选择。两项检测联合，可在报告病原名称的同时给出用药参考，缩短经验性治疗向目标性治疗转换的时间，提高抗真菌治疗的针对性。
临床与科研应用场景
临床领域用于侵袭性真菌感染的病原学诊断，尤其适用于培养形态不典型、生化反应不明确的菌株，以及双相真菌与少见酵母的鉴别。医院感控方面可依据序列同源性追溯感染来源，判断病例间菌株的克隆关系。科研领域应用于真菌多样性调查、菌种保藏机构复核鉴定、发酵工业菌种确证及食品与药品微生物限度检查中丝状真菌的溯源分析。环境监测方向可对空气、水体与土壤样本中的真菌进行种类识别，服务于生物安全评估与生态学研究。
常见问题与注意事项
真菌ITSrDNA鉴定结果存疑时如何申请复检与数据异议处理？
若对真菌ITSrDNA鉴定结果有异议，可联系检测机构提出复检申请，机构将结合原始测序数据、序列比对结果与色谱图进行复核，必要时对留存样本重新提取DNA并重复扩增测序，复核后出具书面说明。
真菌ITSrDNA鉴定的检测周期与报告交付方式是怎样的？
检测周期取决于样本类型、DNA提取难度及测序通量安排，临床样本与科研批量样本的处理进度有所不同。报告一般以电子版优先交付，纸质版可按需求提供，内容包含序列信息、比对结果与鉴定结论。
真菌ITSrDNA鉴定对样品数量与寄送有哪些要求？
不同样本类型（如菌落、组织、血液或环境样品）所需数量与保存方式不同，一般要求样本新鲜、避免反复冻融并使用无菌容器密封寄送；批量送样前建议提前与检测机构沟通确认数量、标识与运输条件。
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