small RNA高通量测序以18—30 nt左右的小分子RNA为检测对象，覆盖microRNA、siRNA、piRNA及tsRNA等非编码小RNA。检测过程样本制备、文库构建、测序与生物信息分析等环节，可同时获得小RNA序列、长度分布与表达谱信息。该技术适用于多种生物样本，用于表达差异分析、标志物筛选与机制研究，是当前非编码RNA研究中的主流检测手段。
检测原理与机制
small RNA是一类长度约18—30 nt的非编码RNA分子，主要microRNA、siRNA、piRNA及tRNA衍生小RNA等。其测序检测基于接头连接与扩增原理：小RNA分子本身缺乏polyA尾与通用引物结合位点，须先在其3′端与5′端分别连接专用测序接头，再经反转录与PCR扩增获得可测序的cDNA文库。测序平台对文库中数百万条分子进行并行读取，获得原始碱基序列。与依赖探针杂交的芯片方法相比，测序法无需预先设定探针，可发现未知小RNA并区分长度相近的异构体。
检测原理与技术平台
主流平台采用边合成边测序原理，以可逆终止荧光标记核苷酸逐轮延伸测序链，同步记录荧光信号并转换为碱基信息。该类平台以读长适中、通量高、单碱基分辨率好为特点，适合小RNA此类短片段的大规模平行测序。测序模式多采用单端读取，读长设置覆盖小RNA全长及部分接头序列即可。实验室通常按通量需求将多个文库经索引条码混合后同机测序，再依据条码序列拆分各样本数据。部分项目辅以长度分选与凝胶纯化步骤，以降低接头二聚体对有效数据的干扰。
样本类型与制备要求
可送检样本类型组织、全血或血清血浆、细胞及体液外泌体等。small RNA片段短、含量低，样本质量直接影响建库成败，取样后应尽快低温保存并避免反复冻融。组织样本建议液氮速冻后置-80 ℃保存；血液样本应避免溶血，分离血清或血浆后再冻存。总量要求随样本类型不同而异，一般以分光光度法与荧光法定量总RNA，并以琼脂糖凝胶或毛细管电泳评估RNA完整性。对于降解程度较高的临床样本，可选用兼容微量或部分降解输入的建库策略。
测序流程与质控要点
标准流程依次为总RNA提取与质检、3′与5′接头连接、逆转录、文库PCR扩增、片段大小分选、文库质检与定量、上机测序及后续信息分析。各环节均设质控节点：建库前核查RNA浓度与纯度，A260/280与A260/230比值应处于合理区间；建库后以毛细管电泳确认文库片段分布峰形，并采用荧光定量法测定文库摩尔浓度，避免上机浓度偏差。原始数据质控内容碱基质量分布、接头残留比例、长度分布统计及低质量序列剔除。比对分析时须依据参照基因组注释，区分已知小RNA与新候选序列。
检测性能指标
评价该检测的常规指标测序原始数据量、有效数据比例、Q30碱基占比、比对率及重复性。有效数据指经去接头、去低质量与长度筛选后可用于后续分析的高质量读段，其占比反映建库纯度与分析可靠性。重复性以生物学重复样本间表达量的相关性衡量，相关性越高表明数据稳定性越好。检出能力受样本RNA输入量、文库复杂度及测序深度共同影响；微量样本或高接头残留会降低有效读段比例。差异表达分析一般要求每组设置适量生物学重复，以控制统计假阳性。
应用场景与送检建议
该检测适用于疾病标志物筛选、发育与分化机制研究、药物作用机制分析及微生物small RNA研究等方向。常见送检设计为病例组与对照组比较，每组建议三例以上生物学重复，并注明样本类型、保存条件与预期目的物种。血清血浆等游离small RNA样本含量低，送检前应确认样本体积满足要求。委托方宜预先沟通检测目的、参照基因组版本及报告需求，如是否需要新小RNA预测、靶基因预测或差异表达分析。样本运输全程应维持低温条件，并附样本清单与唯一标识，避免运输过程反复冻融导致RNA降解。
常见问题与注意事项
small RNA高通量测序送检前需要与检测机构沟通哪些要点？
应确认样本类型是否符合small RNA高通量测序的接收要求，明确制备与保存运输条件，了解测序平台、数据量及质控节点，并就检测周期、报告形式和可能出现的问题样本处理方式提前约定。
影响small RNA高通量测序检测费用的主要因素有哪些？
费用主要与样本数量和类型、文库制备难度、测序数据量大小、所选技术平台以及是否需要额外的生信分析有关；不同应用场景（如疾病标志物筛选或基础研究）对数据深度要求不同，价格也会有差异，建议送检前向机构索取明细。
对small RNA高通量测序结果有异议时如何处理？
可与检测机构沟通复核原始数据与质控记录，确认样本制备、测序流程是否存在异常环节；必要时在同一样本基础上按机构流程申请复检，并结合质控指标判断数据质量，协商出具补充说明或重新出具报告。
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