皮肤变态反应：局部淋巴结试验_【CMA/CNAS认证】

皮肤变态反应是机体对化学物产生的迟发型超敏反应，局部淋巴结试验（LLNA）作为体内替代方法，以淋巴细胞增殖程度量化致敏强度。本文围绕该试验展开，依次介绍致敏机制、受试物制备与给药方案、操作流程、判定指标及适用范围，并与体外替代方法比较。读者可据此掌握该试验的完整实施要点与技术定位，为化妆品原料、化学物质及医疗器械浸提液的致敏性评价提供方法参考。

检测原理与机制

局部淋巴结试验基于致敏诱导阶段的免疫学事件建立。化学致敏物 penetrates 皮肤后，与表皮蛋白形成半抗原结合物，经朗格汉斯细胞摄取加工，递呈至引流淋巴结内的T淋巴细胞，引发抗原特异性T细胞活化与克隆增殖。该增殖反应与致敏效力存在剂量依赖关系，据此以淋巴结细胞增殖水平作为致敏性的定量评价指标。试验仅评估诱导阶段，不进行激发步骤，动物福利负担低于传统豚鼠最大化试验。

检测原理与致敏评价机制

从机制层面看，致敏物引发的增殖信号可通过多个维度表征。淋巴细胞在增殖过程中合成DNA，掺入的示踪核苷量与细胞分裂速率成正比，构成放射性核素标记定量的理论基础。同时，活化T细胞分泌细胞因子并表达活化标志物，可采用ELISA检测培养上清中白细胞介素水平，或以流式细胞术分析表面标志表达。上述信号共同支撑致敏效力的分级评价，即将刺激指数与阈值比对，判定受试物是否具有致敏性及强弱程度。

受试物制备与动物给药方案

受试物首选适当溶剂或分散介质配制成系列浓度，常用介质丙酮与橄榄油混合液、二甲基亚砜、乙醇及水溶性介质，选择原则为保证局部涂布均匀且不产生刺激毒性。正式试验前应进行预试验确定最高耐受浓度，避免皮肤过度刺激干扰结果。试验对象为雌性未生育小鼠，于双耳背侧连续三天局部涂皮给药，设至少三个浓度组，另设溶剂对照与阳性对照组。阳性对照物应定期验证试验系统的敏感性。

局部淋巴结试验操作流程

操作按固定时序执行。第一、二、三天每日于耳背涂布受试物，第四至五天休药，第五天或第六天注射示踪核苷，注射后约一日处死动物，摘取双侧耳后引流淋巴结。淋巴结经研磨制备单细胞悬液，经纱布过滤去除组织碎片，洗涤后计数细胞并转移至检测体系。放射性标记方案测定掺入量，非放射性方案可采用BrdU-ELISA法，以酶标仪读取吸光度反映增殖水平。全程设置对照组平行操作，以消除系统误差。

检测指标与结果判定标准

核心指标为刺激指数，即各剂量组增殖测定值与溶剂对照组均值之比。刺激指数不低于既定的判定阈值时，判为致敏阳性；低于阈值判为阴性。阳性结果应呈剂量反应趋势，若高浓度组出现毒性抑制，需结合局部刺激表现综合研判。辅以耳廓厚度测量与淋巴结重量记录，用于区分刺激性炎症与特异性致敏反应。结果显示受试物具有致敏性时，可依据最低致敏浓度进行效力分级，用于比较不同物质的致敏强度。

适用范围与替代方法比较

局部淋巴结试验适用于各类可经皮接触的化学物致敏性筛选，覆盖化妆品原料、工业化学品、消毒产品及医疗器械浸提液等多种检测对象。与豚鼠最大化试验相比，其周期短、动物用量少、判定客观量化。在替代方法体系中，直接多肽反应试验、氨基酸衍生化反应试验考查半抗原与蛋白的反应活性，人细胞系活化试验与U937细胞激活试验考查细胞活化通路，均属体外方法。单一方法信息有限，按整合测试策略组合使用，可减少动物使用并提升评价可靠性。