体内哺乳动物肝细胞DNA损害修复/程序外DNA合成试验_【CMA/CNAS认证】

体内哺乳动物肝细胞DNA损害修复/程序外DNA合成试验（In vivo UDS试验）是以啮齿类动物肝原代细胞为对象的遗传毒性检测方法。受试物经体内染毒后，分离肝细胞进行原代培养，在羟基脲抑制半保留DNA的条件下，以放射性胸苷掺入标记程序外DNA合成水平，借此反映受试物对DNA的损伤及其切除修复能力。本文围绕检测原理、样品制备、放射自显影测定、对照设置与判定标准、应用场景与报告要点等模块展开，为委托方与方法使用者提供操作层面的参考。

检测原理与机制

程序外DNA合成（UDS）是细胞在化学或物理因素造成DNA损伤后启动的切除修复应答。损伤碱基经核酸切除修复途径识别并被切除，修复链段填补过程伴随DNA聚合酶介导的合成反应，该合成发生于正常细胞周期S期之外，故称程序外DNA合成。肝细胞富含代谢酶系，可将前体化合物活化为亲电子代谢物，因而成为体内试验中考察DNA损伤与修复的适宜靶细胞。受试物若具有损伤DNA的潜力，肝细胞内UDS水平即出现可测的升高，构成该试验的生物学基础。

检测原理与终点指标

试验终点为测定期内的净核银颗粒数（NG）与核银颗粒均值（NCG），并以细胞质银颗粒数（CG）校正放射活性本底，两者之差反映³H-胸苷在核内的掺入量。判定时同时考察处于修复中的细胞比例与净核颗粒数分布。羟基脲用于抑制常规半保留，使掺入信号归属于修复性合成；处于S期的细胞因信号过强而予以剔除。终点指标直接对应DNA切除修复的量化水平，是区分损伤效应与正常活动的核心依据。

样品制备与染毒方案

受试物需制备为可经口或腹腔注射给予的均匀制剂，溶剂本身不得产生细胞毒性或干扰掺入。常用啮齿类动物设多个剂量组，染毒后于设定时间点取肝，经胶原酶灌注或两步灌流法分散肝细胞，获得活率满足原代培养要求的细胞悬液。细胞接种于载玻片培养体系，加入³H-胸苷与羟基脲共培养后固定制片。剂量设计应覆盖最大耐受剂量至低剂量区间，并设平行采样时点，以捕捉肝内损伤修复的峰值窗口。

放射自显影法测定UDS

制片后覆盖核乳胶，避光干燥后置低温环境曝光数日，再经显影与定影处理，Giemsa染色封片。镜检时逐细胞计数核内与最近胞质区域的银颗粒数，计算每细胞净核颗粒数。计数需由经培训的观察者按统一视野规则完成，随机读取足够数量的细胞，并剔除S期细胞与重叠细胞。放射自显影将放射性掺入转化为可目视的颗粒信号，具备定位至单个细胞核的空间分辨能力，是该试验的常规测定手段。

阳性/阴性对照与判定标准

每次试验须设溶剂阴性对照与已知阳性对照。阳性对照常选用无需体外代谢活化即可在肝内诱发UDS的遗传毒物，用于验证试验系统的敏感性；阴性对照用于核实本底掺入水平。判定一般要求阴性对照的净核颗粒数处于历史对照范围内，阳性对照呈现明确的剂量相关性升高，试验方视为有效。受试物若在任一剂量或时点诱发净核颗粒数超出判定阈值且具有统计学意义与重现性，即判定为阳性结果；反之，在毒性限度内未见升高者判为阴性。

应用场景与试验报告要点

该试验适用于化学品、农药、医药中间体及医疗器械可沥滤物的体内遗传毒性评价，常作为体外试验阳性结果的追加确证手段，也用于构效关系存疑物质的分层测试策略。报告应完整载明动物种系、染毒途径与剂量设置、肝细胞活率、曝光与显影条件、对照数据、细胞计数原始记录及统计方法，并附历史对照范围用于结果复核。结论部分须明确给出阳性或阴性判定及其依据，同时说明试验的限度与不确定因素，便于委托方据此开展风险评估。