眼刺激替代试验-荧光素漏出法检测概述

眼刺激替代试验-荧光素漏出法（Fluorescein Leakage Test）是一种基于体外模型评估化学物质对眼部刺激性影响的非动物实验方法，被广泛应用于化妆品、药品、医疗器械及工业化学品的安全性评价。传统眼刺激试验依赖兔眼活体实验，存在伦理争议和种属差异性问题，而荧光素漏出法通过模拟角膜屏障功能损伤，利用荧光素钠的渗透特性量化评估刺激性，具有灵敏度高、重复性好且符合“3R原则”（替代、减少、优化）的特点。该方法的核心原理是：当受试物质破坏角膜上皮细胞层时，荧光素钠可渗透至细胞间隙或深层组织，其渗漏程度与刺激性呈正相关，通过检测荧光强度即可实现快速定量分析。

检测项目

荧光素漏出法主要检测以下项目：
1. 角膜屏障功能完整性：评估受试物质对角膜上皮细胞间紧密连接的破坏程度；
2. 荧光素钠渗透浓度：量化荧光素在角膜模型中的扩散量；
3. 刺激性等级分类：根据荧光强度划分无刺激、轻度刺激或严重刺激等级；
4. 时间依赖性损伤：分析不同暴露时间下的损伤动态变化。

检测仪器

该试验需使用以下关键仪器：
1. 荧光分光光度计：用于精确测定荧光素钠的发射光强度（激发波长490nm，发射波长520nm）；
2. 角膜等效模型培养系统：如EpiOcular™或LabCyte CORNEA-MODEL等三维人工角膜组织；
3. 微孔板读数仪：适用于高通量样本检测；
4. 倒置荧光显微镜：观察荧光素在组织中的分布形态；
5. pH计与渗透压仪：确保试验溶液的理化参数符合标准。

检测方法

实验操作流程分为以下步骤：
1. 样本预处理：将人工角膜模型用生理盐水清洗并平衡至37℃；
2. 荧光素钠负载：在模型表面施加含0.5%-1%荧光素钠的受试物溶液，孵育30-60分钟；
3. 孵育与清洗：去除未结合的荧光素，收集渗透液或直接测量模型内荧光强度；
4. 荧光测定：使用分光光度计或显微镜定量分析渗漏量；
5. 数据分析：通过标准曲线换算荧光素浓度，结合阈值判定刺激性等级。

检测标准

该方法遵循国际与国内标准规范，主要包括：
1. OECD TG 492：《体外角膜刺激性荧光素漏出试验指南》；
2. ISO 10993-10：医疗器械生物学评价中眼部刺激试验的替代方法要求；
3. GB/T 16886.10-2017：中国国家标准中关于医疗器械的刺激试验部分；
4. ECVAM验证协议：欧洲替代方法验证中心对方法可靠性的验证标准。
注：试验需设置阴性对照（生理盐水）和阳性对照（1% SDS溶液），并满足重复试验的变异系数≤15%。

总结

荧光素漏出法作为眼刺激评价的标准化替代方案，通过定量检测角膜屏障损伤程度，显著降低了动物使用率，同时兼具高效性与准确性。其检测结果的可靠性依赖于严格遵循仪器校准、模型质量控制及标准化操作流程。随着器官芯片技术和人工智能数据分析的融合，该方法将进一步优化，成为化学品安全性评估体系中的重要支柱。

检测机构资质证书

CMA认证

检验检测机构资质认定证书

证书编号：241520345370

有效期至：2030年4月15日

CNAS认可

实验室认可证书

证书编号：CNAS L22006

有效期至：2030年12月1日

ISO认证

质量管理体系认证证书

证书编号：ISO9001-2024001

有效期至：2027年12月31日

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