LUMA整体甲基化检测_【CMA/CNAS认证】_中科光析科学技术研究所

DNA甲基化是脊椎动物基因调控的重要表观遗传标记，异常甲基化通常与人类疾病如癌症有关。在哺乳动物中，甲基化主要发生在 CpG二核苷酸背景下的胞嘧啶碱基上。 CpG 岛是具有高 CpG 含量的基因组区域，并且通常位于基因启动子附近，在那里它们调节转录起始。

基因特异性和全基因组 DNA 甲基化可以用多种方法进行分析。LUMA是一种分析全基因组甲基化的快速有效的方法，已经在很多文献中详细描述。LUMA利用某些限制性内切酶的特殊性质，这些内切酶识别相同的靶序列，但是对甲基化敏感或不敏感。其中HpaII 和 MspI 通常用于 DNA 甲基化分析。这些酶识别 ccgg 序列，但只有 MspI 能够切断内部胞嘧啶C甲基化的基因序列。在 LUMA 的第一步，感兴趣的基因组在两个不同的反应中被消化，要么与 HpaII 和 EcoRI，要么与 MspI 和EcoRI。EcoRI作为一个内参酶，评估每个反应的裂解效率。在限制性消化后，使用焦磷酸测序通过单核苷酸延伸以定量方式填充所得的5’-cg ( HpaII 和 MspI)和5’-aatt (EcoRI)粘末端

　LUMA优点是：无需亚硫酸盐修饰，无需引物，无需PCR过程，测序反应无需磁珠等试剂，十分钟左右即可完成测序反应，方便快捷。而且，该实验只需要200-500 ng的基因组DNA，并包含一个内控以消除起始DNA数量不同的问题。整个实验过程能够在6个小时内完成。

5'			C ↓	C	G	G		3‘
3‘			G	G	C ↑	C		5'

HpaII 限制性内切酶可识别 C^CGG 位点，对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化敏感。

MspI 限制性内切酶可识别 C^CGG 位点，对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化不敏感。

5'			G ↓	A	A	T	T	C		3‘
3‘			C	T	T	A	A ↑	G		5'

EcoRI 是一种DNA 的 G^AATTC限制性内切酶，对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化敏感。

材料与方法

应用全基因组 DNA/RNA mini 试剂盒提取待检测样本基因组 DNA。用Nanodrop 2000测定 DNA 浓度。如上所述(1)进行 Luma，但进行了小的修改。在37 °C 的热块中用PCR仪快速限制性消化20分钟。

对于每个 DNA 样品，设置两个不同的反应: 混合 A(HpaII 和 EcoRI)和混合 B (MspI 和EcoRI)。Pyromark q48 autoprep 的反应体积为6.5 μl，由0.25 μl EcoRI，0.25 μl hpaii 或 mspi，0.5 μl 反应缓冲液和5.5 μl dna/水组成。

焦磷酸测序时，将6.5 μl 的酶解产物转移到 Q48圆盘的每个孔中，并通过仪器自动添加6.5 μl 的Pyromark退火缓冲液。将核苷酸依次加入到加样仓中: 50μl dATP 和50μl 水至“ A”，50μl dTTP 和50μl 水至“ T”，50μl dCTP 和50μl dGTP 至“ C”，100μl 水至“ G”。焦磷酸测序分配序列按照 ACTCGA 核苷酸分配顺序进行。由此产生的热图包含前三个分配的三个主要峰。峰1和3(a 和 t)对应于由 EcoRI 产生的粘末端的填充，并且应该具有相似的高度，并且峰2(c + g)由 HpaII 和 MspI 粘末端的填充产生。后，高峰高度从Pyromark软件输出，并用以下公式计算甲基化水平:

% Methylation = 100 x [1 – (mix A peak 2 / mix A peak 1) / (mix B peak 2 / mix B peak 1)]