DNA甲基化是脊椎动物基因调控的重要表观遗传标记,异常甲基化通常与人类疾病如癌症有关。在哺乳动物中,甲基化主要发生在 CpG二核苷酸背景下的胞嘧啶碱基上。 CpG 岛是具有高 CpG 含量的基因组区域,并且通常位于基因启动子附近,在那里它们调节转录起始。
基因特异性和全基因组 DNA 甲基化可以用多种方法进行分析。LUMA是一种分析全基因组甲基化的快速有效的方法,已经在很多文献中详细描述。LUMA利用某些限制性内切酶的特殊性质,这些内切酶识别相同的靶序列,但是对甲基化敏感或不敏感。其中HpaII 和 MspI 通常用于 DNA 甲基化分析。这些酶识别 ccgg 序列,但只有 MspI 能够切断内部胞嘧啶C甲基化的基因序列。在 LUMA 的第一步,感兴趣的基因组在两个不同的反应中被消化,要么与 HpaII 和 EcoRI,要么与 MspI 和EcoRI。EcoRI作为一个内参酶,评估每个反应的裂解效率。在限制性消化后,使用焦磷酸测序通过单核苷酸延伸以定量方式填充所得的5’-cg ( HpaII 和 MspI)和5’-aatt (EcoRI)粘末端
LUMA优点是:无需亚硫酸盐修饰,无需引物,无需PCR过程,测序反应无需磁珠等试剂,十分钟左右即可完成测序反应,方便快捷。而且,该实验只需要200-500 ng的基因组DNA,并包含一个内控以消除起始DNA数量不同的问题。整个实验过程能够在6个小时内完成。
5' |
C ↓ |
C |
G |
G |
3‘ |
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3‘ |
G |
G |
C ↑ |
C |
5' |
HpaII 限制性内切酶可识别 C^CGG 位点,对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化敏感。
MspI 限制性内切酶可识别 C^CGG 位点,对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化不敏感。
5' |
G ↓ |
A |
A |
T |
T |
C |
3‘ |
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3‘ |
C |
T |
T |
A |
A ↑ |
G |
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EcoRI 是一种DNA 的 G^AATTC限制性内切酶,对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化敏感。
材料与方法
应用全基因组 DNA/RNA mini 试剂盒提取待检测样本基因组 DNA。用Nanodrop 2000测定 DNA 浓度。如上所述(1)进行 Luma,但进行了小的修改。在37 °C 的热块中用PCR仪快速限制性消化20分钟。
对于每个 DNA 样品,设置两个不同的反应: 混合 A(HpaII 和 EcoRI)和混合 B (MspI 和EcoRI)。Pyromark q48 autoprep 的反应体积为6.5 μl,由0.25 μl EcoRI,0.25 μl hpaii 或 mspi,0.5 μl 反应缓冲液和5.5 μl dna/水组成。
焦磷酸测序时,将6.5 μl 的酶解产物转移到 Q48圆盘的每个孔中,并通过仪器自动添加6.5 μl 的Pyromark退火缓冲液。将核苷酸依次加入到加样仓中: 50μl dATP 和50μl 水至“ A”,50μl dTTP 和50μl 水至“ T”,50μl dCTP 和50μl dGTP 至“ C”,100μl 水至“ G”。 焦磷酸测序分配序列按照 ACTCGA 核苷酸分配顺序进行。由此产生的热图包含前三个分配的三个主要峰。峰1和3(a 和 t)对应于由 EcoRI 产生的粘末端的填充,并且应该具有相似的高度,并且峰2(c + g)由 HpaII 和 MspI 粘末端的填充产生。运行后,高峰高度从Pyromark软件输出,并用以下公式计算甲基化水平:
% Methylation = 100 x [1 – (mix A peak 2 / mix A peak 1) / (mix B peak 2 / mix B peak 1)]
检测周期短
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