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益生菌检测

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发布时间：2025-03-11 13:53:33 更新时间：2025-03-10 13:55:21

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

益生菌检测需围绕 活菌计数、菌种鉴定、安全性、功能特性 等核心指标展开，结合国际标准（如ISO 19344、ISO 15214）及国内规范（如GB 4789.34、GB 4789.35），确保其在食品、保健品及医疗制品中的有效性、安全性与合规性。以下是系统化的检测方案与操作指南：

检测类别	关键指标	检测方法	标准依据
活菌计数	总活菌数（CFU/g或CFU/mL）	平板计数法、流式细胞术（FCM）	ISO 19344 / GB 4789.34
菌种鉴定	菌株特异性（16S rRNA测序、PCR）	基因测序、特异性引物扩增	ISO 15214 / GB 4789.35
安全性	致病菌（沙门氏菌、金黄葡萄球菌）	选择性培养基培养+生化鉴定	GB 29921
耐药基因筛查	抗生素抗性基因（如ermB、tetM）	实时荧光定量PCR（qPCR）	EFSA 2021指南
功能特性	耐酸耐胆盐能力、粘附性	体外模拟胃肠消化实验（SGID模型）	FAO/WHO 2002指南
代谢产物	短链脂肪酸（SCFAs）含量	气相色谱法（GC-FID）	AOAC 999.10

步骤：
1. 梯度稀释样品（如10⁻⁶~10⁻⁸），选用MRS培养基（乳酸菌）或特定选择性培养基。
2. 涂布平板，37℃厌氧培养48小时，计数典型菌落。
3. 计算：活菌数=平均菌落数×稀释倍数样品量（mL或g）活菌数=样品量（mL或g）平均菌落数×稀释倍数
- 合格标准：产品标示值≥标称值的90%（如标称1×10¹⁰ CFU/g，实测≥9×10⁹ CFU/g）。

步骤：
1. 提取细菌DNA（CTAB法或试剂盒）。
2. PCR扩增16S rRNA基因（通用引物27F/1492R）。
3. 测序后与NCBI数据库比对（相似度≥99%确认菌种）。
注意：需结合生化试验（如API 50CH）验证代谢特性。

模拟胃液：pH 2.0（含3g/L胃蛋白酶），37℃振荡2小时。
模拟肠液：pH 6.8（含0.3%牛胆盐），37℃振荡4小时。
存活率计算：存活率=处理后活菌数初始活菌数×100%存活率=初始活菌数处理后活菌数×100%
- 合格标准：存活率≥50%（高活性菌株如L. rhamnosus GG）。

引物设计：针对常见抗性基因（如ermB、tetM、vanA）。
判定标准：
- 必要基因：固有耐药（如双歧杆菌对万古霉素抗性）可接受。
- 获得性基因：携带可转移抗性基因（如tetM）的菌株不得用于食品。

参数	中国标准（GB 4789.34）	国际标准（ISO 19344）	功能要求（FAO/WHO）
活菌数	≥标称值的90%	≥标称值的80%	保质期内≥1×10⁹ CFU/日剂量
致病菌	沙门氏菌/金黄葡萄球菌不得检出	符合EC 2073/2005	无致病性/毒性
耐酸存活率	≥50%	≥50%	体内定植能力验证

问题	原因分析	优化措施
活菌数衰减快	保存温度不当或水分活度高	低温干燥储存（≤4℃、Aw≤0.25），添加保护剂（海藻糖）
菌种交叉污染	扩增引物特异性差	设计菌株特异性引物（如L. acidophilus LA-5特异性基因）
耐酸性不足	菌株筛选不严或预处理不当	定向进化筛选耐酸菌株，预适应培养（pH 4.0缓冲液）
抗性基因假阳性	环境DNA污染	加强样品前处理（DNase I消化），设置阴性对照

食品/保健品：
- 必检项：活菌数、菌种鉴定、致病菌、保质期稳定性（常温/加速试验）。
- 推荐项：耐酸耐胆盐能力、SCFAs生成量（支持肠道健康声称）。
医疗级益生菌：
- 增检项：耐药基因筛查、免疫调节实验（如IL-10分泌量）、临床菌株溯源（全基因组测序）。
宠物益生菌：
- 增检项：耐高温制粒测试（85℃×5min存活率≥10%）、动物安全性试验。