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动物转移因子活性检测

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发布时间：2025-03-12 15:43:52 更新时间：2025-03-11 15:47:13

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作者：中科光析科学技术研究所检测中心

动物转移因子（Transfer Factor, TF）是从动物免疫细胞（如淋巴细胞）中提取的小分子多肽，具有传递免疫信息的功能。其活性检测需围绕 免疫调节能力、特异性反应及生物学效价 展开，适用于兽药研发、免疫增强剂评价及生物制品质量控制。以下是基于 《中国兽药典》2020版、FDA-CVM Guideline 1240.3600（免疫调节剂评估） 及 ISO 17025:2017（检测方法验证） 的系统化检测方案：

一、活性检测核心方法

检测方法	原理	适用场景	标准依据
淋巴细胞增殖实验	TF刺激淋巴细胞增殖（MTT法检测代谢活性）	体外免疫活性定量	USP <1032>
迟发型超敏反应（DTH）	致敏动物皮内注射TF，测量红肿直径变化	体内免疫应答评估	OECD 442
细胞因子释放检测	ELISA法测定IL-2、IFN-γ等细胞因子浓度	免疫调节通路分析	ISO 17025:2017
动物保护实验	接种病原后TF处理组与对照组的存活率对比	抗感染效力验证	FDA-CVM 1240.3600

二、标准化检测流程（以淋巴细胞增殖实验为例）

1. 样品制备

TF提取：
1. 取动物脾脏淋巴细胞，冻融裂解后超滤（截留分子量3.5~10 kDa）；
2. 透析脱盐，冻干保存（活性损失≤5%）。
阳性对照：刀豆蛋白A（ConA，5μg/mL）；阴性对照：RPMI-1640培养基。

2. 实验步骤

细胞培养：
- 小鼠脾淋巴细胞悬液（1×10⁶ cells/mL）接种于96孔板，每孔100μL；
- 加入TF样品（梯度浓度：0.1~100μg/mL）或对照，37℃、5% CO₂培养72h。
MTT检测：
- 每孔加MTT溶液（5mg/mL，10μL），继续孵育4h；
- 加入DMSO 100μL溶解甲臜结晶，酶标仪测570nm吸光度（OD值）。
活性计算：
- 增殖率 =（OD样品 - OD阴性） /（OD阳性 - OD阴性）×100%；
- ED50（半数有效浓度）：通过剂量-效应曲线拟合计算。

3. 数据验证

重复性：同一批次3次实验RSD≤15%；
线性范围：0.5~50μg/mL（R²≥0.98）；
特异性：无内毒素（LAL法检测≤0.1 EU/mL）。

三、关键试剂与设备

设备/试剂	用途	推荐型号/品牌
酶标仪	MTT法吸光度测定	BioTek Synergy H1（多波长检测）
CO₂培养箱	淋巴细胞培养	Thermo Scientific Heracell 150i
超滤离心管	TF分子量截留纯化	Millipore Amicon Ultra-15（10kDa）
ELISA试剂盒	细胞因子定量（IL-2、IFN-γ）	R&D Systems Quantikine®

四、国际与国内标准限值对比

参数	中国兽药典（2020版）	FDA-CVM 1240.3600
ED50要求 ≤20μg/mL（免疫增强剂）	≤50μg/mL（生物制品）	需提供方法验证报告
DTH阳性反应红肿直径≥5mm（48h）	显著差异（p<0.05）	动物伦理审查合格
细胞因子释放 IL-2≥100pg/mL（有效剂量）	剂量依赖性（R²≥0.95）	标准曲线线性符合要求

五、检测报告与质量控制

报告内容：
- TF来源（牛、猪、禽类）、批号、制备工艺；
- 检测数据（ED50、增殖率、细胞因子浓度、DTH结果）；
- 结论（如“符合《中国兽药典》免疫增强剂活性要求”）。
质控要点：
- 每批次检测内毒素（LAL法）和微生物污染（需无菌）；
- 活性稳定性测试（4℃保存30天活性≥90%）。

六、常见问题与解决方案

问题	可能原因	解决方案
增殖率低	TF活性降解或浓度不足	优化提取工艺（避免反复冻融）
背景值高	内毒素污染或细胞死亡	使用去内毒素试剂，缩短培养时间
数据波动大	细胞密度不均或操作误差	标准化细胞计数，重复实验≥3次